一种肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异T细胞，及其分离扩增和应用

本发明涉及一种肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异t细胞，及其分离扩增和应用，尤其涉及circfam53b多肽在制备反应性t细胞与非反应性t细胞中的应用，属于生物工程和生物治疗领域。

背景技术：

1、过继性细胞免疫治疗(adoptive cell transfer therapy,act)，是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。与传统的治疗方法相比，过继性细胞免疫治疗具有安全性高、治疗精准、疗效持久等特点。近10年来，随着免疫细胞、基因编辑等基础理论与技术手段的不断发展，过继性细胞免疫治疗成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗手段，为大量恶性肿瘤治疗带来了新的希望。

2、过继性免疫细胞治疗用到的免疫细胞按是否经基因工程改造可分为两大类：未经改造的主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(til)、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)等；经基因工程改造的主要包括嵌合抗原受体t细胞(car-t)、t细胞受体t细胞(tcr-t)、嵌合抗原受体自然杀伤细胞(car-nk)等。

3、未经改造的免疫细胞制备过程相对简单，成本较低，但临床效果欠佳。制备过程大致包括：①组织或体液分离提取活性细胞；②细胞体外诱导、扩增培养；③细胞收集、检测；④细胞回输治疗。基因工程改造的免疫细胞显示出较好的临床治疗效果，但制备过程繁琐，技术要求高，成本高昂，难以惠及大多数肿瘤患者。制备过程大致包括：①筛选肿瘤特异性抗原，以及对该抗原具有高度特异性的基因序列；②从患者体内分离出免疫细胞；③构建包含抗原高度特异性基因序列的病毒载体；④病毒转染免疫细胞；⑤细胞体外培养、扩增；⑥细胞收集、检测；⑦细胞回输治疗。

4、当前，未经改造的过继性细胞免疫治疗的t细胞主要来自外周血、肿瘤组织、腹水。外周血来源的t细胞中，肿瘤特异性t细胞含量极少，且大部分t细胞属于终末期效应t细胞，寿命较短。肿瘤组织和腹水来源的t细胞有部分识别肿瘤的能力，但由于处于肿瘤微环境中，t细胞抗肿瘤能力受到抑制，且大多处于耗竭状态。因此，如何从患者体内获取数量更多、活性更强的肿瘤特异性t细胞，以期获得更好的治疗效果，是临床亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明一方面提供了一种制备肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异t细胞的方法，其包括如下步骤：

2、1、引流淋巴结免疫细胞(prelnl)的制备；

3、2、circfam53b多肽特异性t细胞的筛选；

4、3、引流淋巴结来源的淋巴细胞(lnl细胞)的激活和扩增；

5、4、lnl细胞的收集，并验证circfam53b反应性t细胞与非反应性t细胞的肿瘤杀伤能力。

6、发明人发现，由于引流淋巴结是从癌症患者获得的淋巴组织，其中包含需要分离的特异性t细胞，在从引流淋巴结中分离t细胞时，需要先用消化酶等对引流淋巴结进行消化，从组织中释放出t细胞，再用特异性抗原来识别特异性t细胞。

7、因此，根据本发明的优选实施方案中，在步骤1中，包括在从引流淋巴结中分离t细胞时，先对引流淋巴结进行消化的步骤，以及将消化后的细胞及组织沉淀置于培养箱(例如37℃)中培养的步骤。

8、更优选地，在步骤1中，包括将消化后的细胞及组织沉淀置于37℃、5％co2培养箱中培养一段时间，优选24-48小时。

9、根据多批次实验数据对比，本发明将消化后的细胞及组织沉淀置于37℃、5％co2培养箱培养24hr后，再进行70μm滤网过滤、ficoll分离等步骤，获取的引流淋巴结来源prelnl数量明显多于消化后直接分离得到的prelnl。

10、在本发明优选的实施方案中，在步骤1中还包括组织及外周血的获取、自体血清分离、和肿瘤组织冻存的步骤。

11、在本发明优选的实施方案中，在步骤1之后，在步骤2之前，还包括引流淋巴结免疫细胞(prelnl)的冻存和复苏的步骤。

12、在本发明优选的实施方案中，冻存引流淋巴结免疫细胞(prelnl)的细胞冻存液为含10％dmso、40％aim-v和50％自体血清的细胞冻存液。

13、在本发明优选的实施方案中，在引流淋巴结免疫细胞(prelnl)复苏的过程中，向细胞悬液中加入1mg/ml的i型dna酶，37℃、5％co2培养箱中温浴10min。

14、在本发明优选的实施方案中，在步骤2中还包括树突状细胞(dc细胞)的制备。

15、在本发明优选的实施方案中，在步骤3中，采用流式分选出circfam53b反应性t细胞与非反应性t细胞，并分开培养。

16、在本发明优选的实施方案中，在步骤3中，采用含5％ab血清、2.5％supergrow、1000u/ml rhil-2、20ng/ml rhil7、20ng/ml rhil15、2ng/ml rhil21的aim-v培养体系扩增lnl细胞。

17、本发明另一方面提供了根据本发明所述的方法制备的肿瘤特异t细胞。

18、本发明另一方面提供了circfam53b多肽在制备肿瘤特异t细胞中的应用，其中circfam53b多肽序列优选为alfrltnra，核苷酸序列为：gccctcttcagattgaccaaccgagca。

19、本发明再一方面提供了本发明所述的肿瘤特异t细胞在制备治疗癌症的药物中的应用，其中药物优选为细胞制剂，癌症优选为乳腺癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌。

20、有益效果

21、与现有技术相比，本发明提供的lnl细胞制剂，由于细胞来源于引流淋巴结，改进了细胞获取和培养的方法，并且是流式筛选后分开培养，最终混合应用。优点主要包括以下方面：

22、1、本发明采用引流淋巴结作为t细胞来源，相比外周血、肿瘤组织、腹水等来源的t细胞，肿瘤引流淋巴结来源淋巴细胞(lnl)有其独特的优势，例如：处于免疫耗竭状态的淋巴细胞更少，可获得的淋巴细胞数量更多，靶向抗原更广谱，肿瘤特异性的t细胞比例更高。

23、2、本发明将消化后的细胞及组织沉淀置于37℃、5％co2培养箱培养24hr后，再进行70μm滤网过滤、ficoll分离等步骤，获取的引流淋巴结来源prelnl数量明显多于消化后直接分离得到的prelnl。

24、3、本发明采用含10％dmso+40％aim-v+50％自体血清的细胞冻存液来冻存pbmc及prelnl细胞，减少了采用动物源性血清带来外源风险的可能。

25、4、本发明在细胞复苏过程中，向细胞悬液常规加入1mg/ml的i型dna酶，37℃、5％co2培养箱温浴10min，可去除死细胞释放的dna，避免dna缠绕导致活细胞聚团。

26、5、本发明采用流式分选出circfam53b反应性t细胞与非反应性t细胞，并分开培养，最终共同回输，在circfam53b阳性乳腺癌pdx小鼠模型中，显示出更强的肿瘤抑制效果。

27、6、本发明采用含5％ab血清+2.5％supergrow+1000u/ml rhil-2+20ng/ml rhil7+20ng/ml rhil15+2ng/ml rhil21的aim-v培养体系扩增lnl细胞，可使lnl中有更高比例的中央记忆型t细胞(tcm)，细胞增殖能力、活力更强，输注后体内存活时间更长。

28、7、本发明中未筛选的lnl细胞制剂或circfam53b反应性t细胞+非反应性t细胞组成的混合lnl细胞制剂，可用于包括但不限于：乳腺癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等的临床治疗。