两种淀粉水解能力增强的麦芽六糖淀粉酶突变体及其制备方法和应用

1.本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及两种淀粉水解能力增强的麦芽六糖淀粉酶突变体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.淀粉是自然界最为丰富的多糖之一，是极为重要的食品和工业原料。淀粉糖的制备是淀粉加工的重要方向之一，其中利用淀粉酶的内切和葡萄糖糖化酶的外切作用将淀粉转化为可发酵葡萄糖已广泛应用于乙醇发酵行业中，此外，利用α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉脱支酶和分支酶、糖基转移酶等酶的催化作用，应用于对淀粉的改性以提高其工业应用价值，增强淀粉的营养品质，以及将淀粉转化为高值的麦芽糊精或者麦芽低聚糖等方面，目前已引起广泛的关注。目前商品化淀粉酶主要来源于芽孢杆菌等细菌和木霉、曲霉等真菌，其中为了适应淀粉高温糊化的前处理，工业淀粉酶多数需要具备耐高温的特性。为了提高酶的催化效率，研究人员针对酶的耐热性和催化活性进行多方面的改造，然而多数是以枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌等细菌，曲霉等真菌来源的淀粉酶作为模板，且主要通过提高盐桥、氢键结合力，增加ca
2+
结合力与底物结合能力等方式。中温淀粉酶是一类具有具重要应用潜力的重要工业用酶，在中温范围内(30-60℃)发挥最大的催化活性，而温度高于80℃则快速失活，这种特性使其在低温和中温催化降低能耗等方面具有重要的作用，同时中温催化、高温失活的特性也是其在烘焙领域具有重要的应用价值。
3.来源于粘细菌珊瑚球菌corallococcus sp.egb的麦芽六糖淀粉酶amym是一种能够将可溶性淀粉转化为以麦芽六糖为主产物的中温淀粉酶(zl201310043628.5)，对糊化淀粉和生淀粉均具有较高的催化效率(amym,a novel maltohexaose-formingα-amylase from corallococcus sp.strain egb.appl environ microbiol,2015,8(6):1977-1987；efficient hydrolysis of raw starch by a maltohexaose-formingα-amylase from corallococcus sp.egb.lwt-food sci technol,2021,152:112361)。该麦芽六糖淀粉酶amym在食品烘焙方面能够显著提高面包的品质，延长面包的货架期，其作用效果优于商业化烘焙用酶(improvement of the quality and shelf life of wheat bread by a maltohexaose producingα-amylase.j cereal sci,2019,87:165-171)，表明其在淀粉酶法转化和改善淀粉基食品品质方面具有重要的应用潜力。为了推动淀粉酶amym的工业应用，减低使用成本，需要进一步提高该蛋白对淀粉的催化效率。本发明采用序列进化分析和结构域截短表达的方法来获得活性提高的变体蛋白。


技术实现要素：

4.为提高淀粉酶的底物催化效率以满足淀粉加工领域的要求，本发明提供了两种淀粉水解能力增强的中温麦芽六糖淀粉酶突变体amym-a382t和amym-tr2。
5.本发明的另一目的是提供所述突变体的应用。
6.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
7.一种上述的淀粉酶突变体amym-a382t和amym-tr2的氨基酸序列，所述序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。
8.编码本发明所述的淀粉酶突变体的基因。
9.作为本发明的一种优选，其基因序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
10.本发明还提供能表达上述淀粉酶突变体amym-a382t和amym-tr2的载体。
11.本发明的另一目的是提供含有该淀粉酶突变体amym-a382t和amym-tr2的基因工程菌，该基因工程菌优选为毕氏酵母和枯草芽孢杆菌。
12.本发明还提供了上述淀粉酶突变体的制备方法，以专利号为“zl 201310043628.5”，名称为“一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用”中所述的淀粉酶amym序列为基础，将第382位的丙氨酸ala替换为苏氨酸thr，获得amym-a382t的氨基酸序列(seq id no.3)，将淀粉酶amym蛋白的第423位至第522位氨基酸之间的片段删除，获得amym-tr2的氨基酸序列(seq id no.4)。
13.本发明所述的淀粉酶突变体amym-a382t对生淀粉和可溶性淀粉的活性和转化效率显著提高，以可溶性淀粉为底物活性与淀粉酶amym相比提高39％；以不同来源生淀粉为底物，amym-a382t活性与淀粉酶amym相比提高20-90％。淀粉酶突变体amym-tr2对生淀粉的活性显著提高，以不同来源生淀粉为底物，amym-tr2活性与淀粉酶amym相比提高35-100％。
14.本发明所述amym-tr2在面包烘焙实验中，添加相同活力单位的蛋白量，与淀粉酶amym相比，突变体amym-tr2对面包品质的提高更具效果。
15.本发明所述麦芽六糖淀粉酶突变体amym-a382t和amym-tr2蛋白质在淀粉基食品加工方面的应用。
16.本发明所述淀粉酶突变体蛋白质在可溶性淀粉液化、糖化以及制备高品质麦芽低聚糖方面的应用。
17.本发明所述淀粉酶突变体蛋白质在淀粉加工和食品方面的应用。
18.有益效果
19.1.本发明以专利号为“zl 201310043628.5”，名称为“一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用”中所述的淀粉酶amym基因和氨基酸序列为基础，通过多序列进化分析，获得关键氨基酸和结构域，通过多位点突变和截短表达，成功获得了催化效率显著提高的淀粉酶突变体蛋白amym-a382t和amym-tr2，其中amym-a382t是麦芽六糖淀粉酶amym第382个氨基酸由ala突变为thr获得的，该突变体与amym相比，显著提高了对可溶性淀粉和生淀粉的水解活性；amym-tr2是麦芽六糖淀粉酶amym的第423位至第522位氨基酸之间的片段删除获得的，该突变体与amym相比，显著提高了对生淀粉的水解活性。
20.2.将amym-tr2与amym应用于小麦面包烘焙中，在相同活力单位的蛋白添加量条件下，面包品质测定结果显示，突变体amym-tr2与amym相比显著提升了面包的体积，改善了面包的硬度、咀嚼性，提升了面包的弹性、恢复力以及粘结性；此外，突变体amym-tr2与amym均提高了面包中抗性淀粉和慢消化淀粉的含量，而与amym相比，突变体amym-tr2降低了淀粉的消化速率。
21.3.利用该突变体蛋白编码基因构建的工程菌株能高效表达突变体蛋白，生产的酶制剂可用于淀粉加工、食品工业、发酵等工业。
附图说明
22.图1淀粉酶突变体蛋白基因的pcr扩增验证图
23.m：dna marker；ck:阴性对照
24.图2淀粉酶突变体蛋白基因在毕氏酵母和枯草芽孢杆菌中异源表达方案图
25.(a)以毕氏酵母为宿主的表达方案图；(b)以枯草芽孢杆菌为宿主的表达方案图
26.图3纯化获得的突变体重组蛋白的sds-page分析图
27.m：蛋白marker；-：不含目的基因的酵母表达酶液
28.图4淀粉酶突变体蛋白对淀粉水解产物的比较分析
29.(a):热处理淀粉产物；(b)：小麦生淀粉产物；m：糖marker；1：amym；2：amym-a382t；3：amym-tr2
具体实施方式
30.实施例1淀粉酶突变体蛋白amym-a382t和amym-tr2的基因克隆
31.以专利号为“zl 201310043628.5”，名称为“一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用”中所述的淀粉酶amym基因和氨基酸序列为参考，进行α-淀粉酶突变体蛋白的pcr扩增(图1)。选取amym第382位的丙氨酸ala，利用定点突变试剂盒将其突变为苏氨酸thr，获得突变体amym-a382t的基因序列，如seq id no.1所示，使用引物f1为seq id no.5，r1为seq id no.6，f2为seq id no.7，r2为seq id no.8。
32.将amym氨基酸序列中的第423位至第522位氨基酸删除，即去掉该蛋白在c末端的糖水化合物结合域，单独表达n端前422位氨基酸，获得突变体amym-tr2的基因序列，如seq id no.2所示，使用引物为f2为seq id no.7，r3为seq id no.9。
33.实施例2淀粉酶突变体蛋白在毕氏酵母中的表达与活性测定
34.以毕氏酵母作为表达宿主，将淀粉酶突变体蛋白编码基因的pcr扩增产物通过酶连转化连接至pefaa载体上，构建pefaa-amym-a382t和pefaa-amym-tr2质粒，经测序验证后，将构建好的质粒利用限制性内切酶sca i对正确的重组质粒进行线性化，利用电转的方法将线性化质粒导入到毕赤酵母gs115感受态细胞中(图2a)。将电转后的菌液涂布到含有100μg/ml zeocin的ypd平板上，待长出后使用目的基因的特征引物进行菌落pcr，以检测目的基因是否整合到酵母染色体中。阳性克隆命名为p.pastoris gs115(pefaa-amym-a382t)和p.pastoris gs115(pefaa-amym-tr2)。将表达菌株p.pastoris gs115(pefaa-amym-a382t)划线平板培养，挑取单菌落至50ml液体ypd三角瓶中，28℃，200rpm培养24h；然后在室温下4000rpm，离心5min，弃去上清液，将菌体用25ml bmmy培养基重悬，开始诱导酵母细胞的表达；继续28℃条件下，200rpm培养，每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，共培养96h；待培养结束后，检测目的蛋白的酶活,以zl 201310043628.5中公开的amym做平行对照。利用sds-page对表达的蛋白进行分析(图3)，amym-a382t、amym-tr2表达量分别为0.03、0.27mg/ml，并利用dns法对发酵上清中的淀粉酶活力进行测定，结果表明amym-a382t对可溶性淀粉的比活力为19000u/mg，与amym相比提高39％；对大米生淀粉的比活力为187u/mg，与amym相比提高95％。淀粉酶突变体蛋白amym-tr2表达与活性测定方法同上，结果表明amym-tr2对大米生淀粉的比活力为187u/mg，与amym相比提高95％。
35.实施例3淀粉酶突变体蛋白枯草芽孢杆菌中的表达与活性测定
36.以枯草芽孢杆菌作为表达宿主，将淀粉酶突变体蛋白编码基因的pcr扩增产物通过酶连转化连接至含有枯草芽孢杆菌上下游同源臂的pefaa-bs-pac载体上，以重组质粒pefaa-bs-pac-amym-a382t和pefaa-bs-pac-amym-tr2为模板，通过f4/r4引物扩增含上下游同源臂和目的基因的全长基因，使用引物f4如seq id no.10所示，r4如seq id no.11所示。将其与枯草芽孢杆菌sck6超级感受态细胞混合37℃孵育90min进行转化(图2b)，涂布于含1.5％淀粉和100μg/ml zeocin的llb平板上进行筛选阳性转化子，使用目的基因的特征引物进行菌落pcr，以检测目的基因是否整合到枯草芽孢杆菌中。挑取验证正确的阳性转化子至4ml lb液体中37℃、200rpm培养，转接到2
×
sr培养基进行诱导表达，37℃条件下，200rpm培养。培养结束后，通过sds-page对表达的蛋白进行分析，利用dns法对淀粉酶活力进行测定，通过考马斯亮蓝测定所含蛋白含量，amym-a382t、amym-tr2表达量分别为0.05、0.11mg/ml，与在酵母中的酶活相近。
37.实施例4淀粉酶突变体蛋白对淀粉水解产物的比较分析
38.以热处理淀粉为底物，以麦芽六糖淀粉酶amym作为对照，通过水解产物的tlc分析进行产物比较。结果表明，淀粉酶突变体蛋白amym-a382t和amym-tr2均与amym一样具有良好的催化能力，热处理淀粉转化为麦芽六糖为主的麦芽低聚糖混合物(图4a)。然而，与糊化淀粉不同的是，以小麦生淀粉为底物时，淀粉酶突变体蛋白amym-a382t、amym-tr2和amym均将小麦生淀粉转化为以麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖为主的产物(图4b)。
39.实施例5淀粉酶突变体蛋白amym-tr2与amym在面包烘焙中的应用比较分析
40.利用商品小麦粉建立面包烘焙实验，配方为小麦面粉(100g),氯化钠(1.5g),酵母(1.8g),水(40ml),脱脂奶粉(4g),和糖(6g),同时补充0.02mg/kg的淀粉酶，并相同剂量的淀粉酶amym为对照，评估突变体蛋白amym-tr2与野生型amym在改善面包品质方面的差异。结果表明本专利所涉及的淀粉酶突变体蛋白amym-tr2在与amym在相同添加剂量的情况，较amym相比更为显著的提高品质，包括提高面包体积、孔径以及降低硬度等(表)。此外，比较不同淀粉酶处理面包中淀粉的消化特性，结果发现，变体蛋白amym-tr2与amym相比，显著降低了烘焙面包中快消化淀粉rds的含量，提高了抗性淀粉rs的含量。该结果表明基于麦芽六糖淀粉酶amym序列获得突变体amym-tr2在提高面包品质方面更具效果。
41.表1面包的品质特性分析
[0042][0043]
volume：面包体积；l
*
,a
*
,b
*
：代表物体颜色的色度值,分别为百暗度(黑白)、红绿色度、黄蓝色度；cell to total area ratio：孔与总面积的比值；cell density：孔密度；mean cell area：平均孔大小。
[0044]
表2面包的消化特性分析
[0045][0046]
[0047]
rds：快消化淀粉；sds：慢消化淀粉；rs：抗性淀粉；c
∞
：∞时间下淀粉的水解率；k：淀粉水解常数。