lncRNATRSMD在鸡骨骼肌生长发育中的应用

lncrna trsmd在鸡骨骼肌生长发育中的应用
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，具体涉及lncrna trsmd在鸡骨骼肌生长发育中的应用。


背景技术：

2.我国地方鸡遗传资源丰富，地方鸡具有肉质好、抗逆性强等优点，但其生长速度缓慢、饲料利用率低，缺乏市场竞争力，难以产业化，各项生长性能指标亟待提高。长链非编码rna(lncrna)是指长度大于200nt的单链非编码rna，广泛存在于真核生物体内，它作为非编码rna的重要一员，能够通过mres(microrna response elements，mres)竞争性结合mirna，导致下游靶基因表达水平改变，最终达到调控的目的。
3.lncrna通过该途径参与了多种复杂的生物学调控过程，在骨骼肌生长发育中也同样发挥着重要作用。转录组测序技术是一种应用较广泛的高通量测序技术，能够准确、快速、大量挖掘与表型相关的基因以及非编码rna。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明所要解决的技术问题是通过转录组测序技术筛选与鸡骨骼肌生长发育相关的lncrna，最终在20胚龄腿肌组织中筛选得到了lncrna trsmd，该lncrna能够反应鸡骨骼肌生长发育速度快慢，通过选留与检测个体具有全同胞关系的个体，加快鸡育种过程中生长性能指标的快速的改良，因此该lncrna trsmd能够用于调控鸡骨骼肌生长发育速度或加快鸡育种过程中生长性能指标的快速改良。
5.本发明还要解决的技术问题是提供了用于检测的特异性引物对。
6.本发明还要解决的技术问题是提供了一种检测试剂盒及其检测方法。
7.本发明最后要解决的技术问题是提供了所述的特异性引物对、所述的检测试剂盒在对鸡胚胎期骨骼肌生长发育的调控作用中的应用。
8.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了lncrna trsmd在调控鸡骨骼肌生长发育速度中的应用。
9.本发明内容还包括用于检测lncrna trsmd在鸡肉组织表达量的特异性引物对，所述特异性引物对序列如seq id no：l和seq id no：2所示。
10.本发明内容还包括所述的特异性引物对在制备检测鸡肌肉组织中的lncrna trsmd表达量的试剂或试剂盒中的应用。
11.本发明内容还包括一种荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物对。
12.进一步地，所述荧光定量检测试剂盒还包括premix试剂和无酶双蒸水组成。
13.进一步地，所述荧光定量检测试剂盒还包括内参基因β-actin的引物对，所述内参基因β-actin的引物对序列如seq id no：3和seq id no：4所示。
14.本发明内容还包括所述的特异性引物对或所述的荧光定量检测试剂盒在研究或
调控鸡骨骼肌生长发育速度中的应用。
15.进一步地，所述应用为通过荧光定量pcr检测鸡肌肉组织中lncrna trsmd的表达量。
16.本发明内容还包括所述的检测试剂盒的检测方法，具体方法为通过荧光定量pcr检测lncrna trsmd在鸡胚肌肉组织中的表达量。
17.进一步地，所述荧光定量pcr反应体系为：premix试剂、序列如seq id no：1所示的引物、序列如seq id no：2所示的引物、模板cdna、无酶双蒸水。
18.进一步地，所述荧光定量pcr反应体系为：premix试剂10μl；序列如seq id no：1所示的引物0.4μl；序列如seq id no：2所示的引物0.4μl；模板cdna2μl；无酶双蒸水6.8μl。
19.进一步地，所述荧光定量pcr反应体系还包括序列如seq id no：3所示的引物0.4μl；序列如seq id no：4所示的引物0.4μl。
20.本发明在鸡胚孵化至20胚龄时，在具有全同胞关系的家系中各选一只鸡胚，进行破壳取样，提取腿肌组织的总rna进行反转录，得到cdna。利用本发明中lncrna trsmd和内参β-actin的特异性引物对等组成的试剂盒进行荧光定量pcr，pcr反应体系和扩增程序同常规的荧光定量pcr。采用2-δδct
方法对该lncrna在每个个体中的表达水平进行判定，根据表达水平确定其生长速度的高低，在育种中可对与检测个体具有全同胞关系的个体进行选留，该lncrna应用将有助于加快鸡育种过程中生长性能指标的快速改良。
21.有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明提供的特异性引物对和检测试剂盒可用于检测lncrna trsmd在鸡肌肉组织的表达量，检测方法简单快捷，本发明提供的lncrna trsmd可作为检测鸡生长速度的一种标志物，在育种中通过检测20胚龄腿肌组织中lncrna trsmd的表达量，能够快速判断其生长速度的快慢，选留与检测个体具有全同胞关系的个体，加快鸡育种过程中生长性能指标的快速改良。
附图说明
22.图1 20胚龄cerna调控网络；
23.图2 qpcr溶解曲线；(a)lncrna trsmd溶解曲线；(b)β-actin溶解曲线；
24.图3 rt-qpcr和rna-seq结果比较。
具体实施方式
25.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
26.实施例1基于rna-seq获得骨骼肌相关lncrna trsmd及其应用
27.1、测序样本的采集
28.实验样本采自山西农业大学(原山西省农科院畜牧研究所)国家级边鸡保种场。以建立的边鸡快长和慢长品系为实验素材，300日龄时，在第七世代边鸡快长和慢长品系中分别选出体重处于群体均值水平的12只母鸡和一只公鸡(表1)，并进行人工授精，收集种蛋建立半同胞家系，种蛋数据见表1，在20胚龄时通过性腺观察法以及chd1基因pcr性别鉴定法
进行公母鸡性别鉴定，采集母鸡的左侧腿肌进行全转录组测序分析，每组4个重复，测序个体体重见表1。
29.表1边鸡快慢品系相关数据统计情况表
[0030][0031]
注：
a，b
不同肩标大写字母表示差异极显著p＜0.01
[0032]
2、差异表达lncrna、mirna和mrna筛选及cerna调控网络构建
[0033]
以p-adjust≤0.05为筛选标准，在20胚龄筛选到77条差异lncrna和256条差异表达的mrna；以p-value≤0.05为筛选标准，在20胚龄的快、慢长品系之间筛选到52条差异表达的mirna。基于cerna机制，构建以lncrna为decoy、mirna为核心、mrna为靶标的lncrna-mirna-mrna调控关系网。由调控网络可知(图1)，lncrna ensgalt00000052303(此lncrna并未命名，我们根据lncrna命名规则将其命名为transcript related to skeletal muscle development，简写为trsmd)(图l黑色箭头处)是位于brt-2基因(图1中浅灰色箭头处)上游的非编码调控rna，通过测序结果可知brt-2在骨骼肌中表达丰度较高，与骨骼肌生长发育密切相关。进一步对测序数据分析发现该lncrna trsmd在慢长组中高表达(表2)，在快长组中几乎不表达，因此，可作为骨骼肌生长发育速度的一种标志物。在育种中可选择舍弃lncrna trsmd高表达个体的全同胞个体，对剩余的种蛋进行继续孵化以及出雏后的饲养，该方案能够有效节约后期的饲养成本，同时加快鸡育种过程中生长性能指标的快速育成。
[0034]
表2转录组测序结果lncrna trsmd表达量
[0035][0036]
注：
a，b
不同肩标大写字母表示差异极显著p＜0.01
[0037]
3、rt-qpcr对lncrna trsmd引物进行验证
[0038]
提取边鸡腿肌组织总rna进行反转录，得到cdna。根据lncrna trsmd的ensembl数据库中序列(登录号为ensgalt00000052303.2)，设计特异性引物对，其序列如seq id no.1和seq id no.2所示，内参基因β-actin引物根据genbank中的序列(登录号：l081565)设计内参基因β-actin引物对，扩增产物大小分别为171bp和169bp。扩增反应体系为20μl，包含premix试剂10μl；序列如seq id no：l和seq id no：2所示的特异性引物各0.4μl(内参基因引物序列如seq id no：3和seq id no：4所示的引物各0.4μl)；模板cdna2μl；无酶双蒸水6.8μl。荧光定量反应程序：95℃预变性30s；95℃10sec，60℃30sec，40个循环；95℃15sec，
60℃60sec，95℃30sec，60℃15sec获得溶解曲线。
[0039]
引物序列如下：
[0040]
lncrna trsmd：f：5
′‑
tcccctccccgattatgc-3
′
seq id no：1
[0041]
r：5
′‑
gcttccaaccgtgttcct-3
′
seq id no：2
[0042]
β-actin：f：5
′‑
cagccatctttcttgggtat-3
′
seq id no：3
[0043]
r：5
′‑
ctgtgatctccttctgcatcc-3
′
seq id no：4
[0044]
由图2可知，lncrna trsmd和β-actin的溶解曲线平滑且具有唯一的主峰，表明引物设计良好。
[0045]
图3的rt-qpcr结果与rna-seq具有高度的一致性。本实验采用实时荧光定量pcr法(rt-qpcr)进行扩增，扩增反应体系为20μl，包含premix试剂10μl；序列如seq id no：1和seq id no：2所示的特异性引物各0.4μl(内参基因引物序列如seq id no：3和seq id no：4所示的引物各0.4μl)；模板cdna2μl；无酶双蒸水6.8μl。荧光定量反应程序：95℃预变性30s；95℃10sec，60℃30sec，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃30sec，60℃15sec获得溶解曲线。
[0046]
本发明提供的试剂盒可用于检测lncrna trsmd在鸡肌肉组织的表达量，试剂盒包含引物序列seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4，预混液premix以及无酶双蒸水。
[0047]
本发明的检测方法简单快捷，提供的lncrna trsmd可作为鸡骨骼肌生长发育速度的标志物。