用作治疗剂的媒介物的间充质干细胞的制作方法

1.本发明可以包括在先进疗法领域中，即细胞疗法、基因疗法或病毒疗法。特别地，本发明涉及一种用于选择或获得间充质干细胞(msc)的方法，msc可以用作治疗剂的转运体或媒介物，特别是在癌症治疗中。


背景技术：

2.病毒疗法、基因疗法或细胞疗法通常应用于肿瘤学，目的是使用msc作为选择性作用于肿瘤的治疗剂的转运体或媒介物。事实上，存在各种针对修饰或调整所述msc以达到提高其在癌症治疗中的治疗能力的目的的策略。例如，可以用条件复制溶瘤病毒感染msc，该病毒选择性地将其抗肿瘤活性应用于肿瘤。可替代地，msc可以具有遗传修饰以达到产生用于治疗癌症的治疗性蛋白的目的。然而，所述msc可以通过纳米颗粒的方式掺入活性成分，甚至可以表现出表面变化以提高其治疗功效。
3.本领域最具创新性的策略之一是使用担当治疗剂的溶瘤病毒以消除或逆转生物体中癌性肿瘤的发展。这些病毒用于治疗目的的用途称为病毒疗法。病毒疗法使用专门设计用于选择性消除肿瘤细胞的病毒。与常规药物不同，这些病毒选择性地在肿瘤中繁殖，因此从非常低的初始剂量起效力可能非常高。
4.近年来，基于病毒疗法已经开发了的各种治疗项目和策略。在用于治疗肿瘤，特别是转移性和难治性儿科肿瘤的病毒疗法领域中表现突出的是被称为celyvir的产品。celyvir由来自患者的msc组成，msc用条件复制溶瘤腺病毒转染。msc能够检测并移动到肿瘤，在其内部沉积负责破坏肿瘤细胞的溶瘤病毒。此外，病毒感染也激活免疫系统，在一些患者中，免疫系统触发其自身免疫系统对肿瘤的反应，从而破坏所述肿瘤。
5.特别地，celyvior包含用icovir-5病毒转染的自体msc。icovir-5(had5-dm-e2f-k-δ24-rgd)是一种源自had5的溶瘤腺病毒并且设计用于播散性肿瘤的全身性治疗。icovir-5基因组含有各种修饰，赋予其在视网膜母细胞瘤/e2f途径失调的肿瘤细胞中选择性复制的能力。icovir-5中所含有的不同遗传修饰是：
6.i)通过e2f-1启动子对部分内源性e1a启动子的取代以控制e1a病毒蛋白(genbank s74230)的表达。e2f1启动子是人来源的非编码序列。该启动子通过pcr使用寡核苷酸从正常人外周血单核细胞获得的dna获得，这些寡核苷酸扩增了e2f-1rgd基因序列的-218和+51位之间的区域。
7.ii)在e2f-1启动子之前分离物序列(dm)的插入。dm-1分离物来自人dm1基因座。该分离物通过pcr使用寡核苷酸从正常人外周血单核细胞获得的dna获得，这些寡核苷酸扩增dm-1基因座序列的13006位和13474位之间的区域(genbank登录号：l08835)。该分离物使病毒基因组中的e2f1启动子分离。
8.iii)起始e1a密码子(k)中kozak序列(ccacc)的插入。该序列有助于mrna翻译机制的识别。
9.iv)在e1a与prb的结合位点8个氨基酸的缺失(δ24个缺失)的存在。
10.v)在病毒纤维的hi环中三肽arg-gly-asp(rgd)的插入。在hi环中插入dgd肽增加病毒的复制能力。
11.celyvir已显示出非常积极的结果，甚至治愈了小儿成神经细胞瘤的病例。然而，为什么一些患者对治疗有积极反应而其他患者没有反应的原因仍然未知。现有研究表明溶瘤病毒的活性可以被患者自身的免疫系统抑制，从而抑制其治疗效果。
12.因此，能够开发一种目的在于选择、获得或产生msc的方法将是非常积极的，这些msc能够有效地递送治疗剂以便选择性地施加其抗癌作用，而不受患者自身免疫系统的影响或抑制。
13.本发明目的在于克服上述技术问题，因为本发明具体涉及一种用于选择、获得或产生msc的方法，这些msc可以用作治疗剂的转运体或媒介物，特别是在癌症的治疗中。


技术实现要素：

14.在花费数年研究在患有实体肿瘤的儿童中进行病毒疗法治疗的结局后，本发明的研究人员得出的结论是，确保用于治疗癌症的病毒疗法真正有效的关键方面之一是存在特别能够隐藏并保护溶瘤腺病毒使其免于患者自身免疫系统识别及消除的msc群体，从而使溶瘤病毒更容易到达转移瘤并增强其抗肿瘤能力。
15.因此，从所述假设开始，本发明得出的结论是，一些msc中存在最佳的分子谱，这使得它们特别能够隐藏并保护溶瘤腺病毒使其免于免疫识别及消除，使得所述溶瘤病毒更容易到达转移瘤并增加其抗肿瘤能力。
16.由于有对celyvir有积极临床反应的患者和其他对所述治疗没有表现出反应的患者，因此比较这两组患者的msc的分子谱用于鉴定负责隐藏并保护溶瘤病毒的分子，从而引起更有效的治疗反应。
17.因此，如本发明所示，对治疗有反应的患者已经接受线粒体抗病毒信号转导蛋白(mavs)基因[基因id：57506]被抑制的msc的治疗，并且显示出比无反应的患者显著更低的基因表达。
[0018]
因此，本发明的第一方面涉及基本上纯的msc群体，其中msc构成总细胞群体的至少80％，其特征在于mavs基因(或其它由所述基因调控的基因)的表达被抑制，或在于mavs蛋白不表达。表达由mavs调控的基因中是例如，il6和ccl2。
[0019]
在优选的方面，来源于骨髓、胎盘、脐带、羊膜、经血、外周血、唾液腺、皮肤和包皮、滑液、羊水、子宫内膜、脂肪组织、脐带血和/或牙齿组织。
[0020]
在优选的方面，msc是自体的或同种异体的。
[0021]
本发明的第二方面涉及所述间充质干细胞，其特征在于mavs基因(或其它由所述基因调控的基因)的表达被抑制，或在于mavs蛋白不表达，以用作治疗剂的转运体或媒介物。
[0022]
本发明的第三方面涉及一种组合物，其包含：i)至少一种细胞，其特征在于mavs基因(或其它由所述基因调控的基因)的表达被抑制，或在于mavs蛋白不表达和ii)至少一种抗原物质。
[0023]
本发明的第四方面涉及一种药物组合物，其包含：i)至少一种细胞，其特征在于mavs基因(或其它由所述基因调控的基因)的表达被抑制，或在于mavs蛋白不表达、ii)至少
一种抗原物质和任选的药学上可接受的媒介物、佐剂和/或赋形剂。
[0024]
在优选的方面，抗原物质是细胞内寄生物。
[0025]
在优选的方面，细胞内寄生物是溶瘤病毒。
[0026]
在优选的方面，细胞内寄生物是溶瘤腺病毒。
[0027]
在优选的方面，细胞内寄生物是icovir-5。
[0028]
在优选的方面，所述药物组合物用作药剂，优选用于治疗实体肿瘤，特别是脑癌、肺癌、肾癌、卵巢癌和/或肝癌、骨癌、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤。
[0029]
本发明的第五方面涉及一种产生(制造)基本上纯的经修饰的间充质干细胞群体的体外方法，其包含：
[0030]
a.从分离样品获得间充质干细胞；
[0031]
b.培养间充质干细胞；
[0032]
c.抑制培养细胞中mavs基因的表达。
[0033]
在优选的方面，该方法还包含用细胞内寄生物感染细胞，优选溶瘤病毒，尤其是icovir-5。
[0034]
本发明的第六方面涉及一种试剂盒，其包含：a)至少一种间充质干细胞；和b)能够抑制mavs基因(或其它由所述基因调控的基因)表达的系统。
[0035]
在本发明的优选方面，所述基本上纯的msc群体选自从患者获得的生物样品中存在的msc，选择表达低水平mavs基因的msc。可替代地，在本发明的优选方面，对msc进行遗传修饰以直接获得不表达mavs蛋白的msc，而不必从生物样品中选择msc。可以使用任何类型的遗传工程对msc进行遗传修饰，该遗传工程用于阻断、抑制或减少mavs基因/蛋白的表达。所述技术的实例可以包括rna干扰、反向寡核苷酸或crispr技术等。
[0036]
在本发明的优选方面，基本上纯的msc群体的特征在于所述细胞用条件复制溶瘤病毒感染。在特定的实施例中，条件复制溶瘤病毒是一种腺病毒，其包含源自肌强直性营养不良基因座的使赋予腺病毒基因选择性表达的启动子分离的人dna序列。在特定的实施例中，条件复制溶瘤病毒是一种腺病毒，其包含赋予肿瘤选择性的e2f1人基因启动子。在特定的实施例中，条件复制溶瘤病毒是一种腺病毒，其包含优化由赋予肿瘤选择性的启动子调控的腺病毒基因的蛋白翻译的kozak序列。在特定的实施例中，条件复制溶瘤病毒是一种腺病毒，其在e1a、e1b和e4组的一个或多个基因中包含突变以实现肿瘤中的选择性复制。在特定的实施例中，条件复制溶瘤病毒是一种腺病毒，其在病毒纤维的hi环中包含rgd三肽。
[0037]
在本发明的优选方面，基本上纯的msc群体的特征在于所述细胞具有遗传修饰以达到产生治疗性蛋白的目的。在特定的实施例中，基本上纯的msc群体的特征在于细胞的遗传修饰通过用选自包括逆转录病毒、慢病毒、杆状病毒或腺相关病毒的组的病毒载体进行转导而发生。在另一具体的实施例中，基本上纯的msc群体的特征在于细胞的遗传修饰通过非病毒转染使用选自包括电穿孔、核转染和声致穿孔的组的物理方法或选自由脂血剂、聚合物载体、树枝状聚合物和无机纳米颗粒组成的组的化学方法来实现。
[0038]
在本发明的优选方面，基本上纯的msc群体掺入治疗剂。在优选的实施例中，基本上纯的msc群体的特征在于其掺入非肽治疗剂和核酸。在另一优选的实施例中，基本上纯的msc群体的特征在于非肽治疗剂和核酸通过聚合物或脂质体纳米颗粒通过细胞内化或结合到细胞表面而掺入细胞中。
[0039]
在本发明的优选方面，基本上纯的msc群体显示出对其表面的修饰以提高其治疗功效。在特定的实施例中，基本上纯的msc群体的特征在于表面的修饰是酶修饰，其包含用粘附配体进行的细胞官能化。在另一特定的实施例中，基本上纯的msc群体的特征在于表面修饰是化学修饰，其包含细胞与配体、肽或聚合物的共价缀合。在另一特定的实施例中，基本上纯的msc群体的特征在于表面修饰是非共价修饰，其中细胞与抗体或肽缀合。
[0040]
为了阐明本发明，包括以下定义：
[0041]
·
在整个本发明中，术语“间充质干细胞(msc)”是指来源于中胚层生发层的多能基质细胞，其可以分化成不同的细胞类型，包括骨细胞(osteocytes/bone cells)、软骨细胞(chondrocytes/cartilage cells)和脂肪细胞(adipocytes/fat cells)。msc表达的标记包括cd105(sh2)、cd73(sh3/4)、cd44、cd90(thy-1)、cd71和stro-1以及cd106、cd166和cd29粘附分子。msc的阴性标记(未表达)尤其包括cd45、cd34、cd14造血标记和cd80、cd86和cd40共刺激分子，以及cd32粘附分子。msc可以但不限于从骨髓、脂肪组织(如皮下脂肪组织)、肝、脾、睾丸、经血、羊水、胰腺、骨膜、滑膜、骨骼肌、真皮、周细胞、小梁骨、人脐带、肺、牙髓和外周血获得。根据本发明的msc可以从任何前述组织获得，如骨髓、皮下脂肪组织或脐带。可以通过本领域技术人员已知的方法从骨髓中分离msc。所述方法通常包括通过骨髓抽吸物的密度梯度离心(ficoll、percoll)分离单核细胞，然后将分离的细胞接种在含有胎牛血清的培养基中的组织培养板上。这些方法基于msc粘附到塑料上的能力，使得当非粘附细胞从培养物中消除时，粘附的msc可以在培养板上培育。也可以按照本领域技术人员已知的类似方法从皮下脂肪组织中分离msc。之前已经描述了一种用于分离骨髓或皮下脂肪组织msc的方法(de lafuente等人，《实验细胞研究(exp.cell res.)》2004，第297:313:328卷)。
[0042]
·
在整个本发明中，术语“基本上纯的群体”是指msc构成群体中总细胞的至少80％，优选群体中总细胞的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞群体。因此，根据本发明的组合物可以包含细胞群体，其中至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的细胞是msc。换言之，在一些实施例中，组合物中至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的细胞是msc。按组合物的数量、重量或体积计算，根据本发明的组合物可以包含至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的msc。
[0043]
·
术语“药物组合物”是指旨在用于疗法的组合物。根据本发明的组合物是旨在用于治疗癌症的再生医学或细胞疗法的药物组合物。根据本发明的组合物可以包括非细胞组分以及本发明所述的群体。此类非细胞组分的实例包括但不限于细胞培养基，其可包含一种或多种蛋白、氨基酸、核酸、核苷酸、辅酶、抗氧化剂和金属。
[0044]
·
在本文件中使用表述“药学上可接受的”是指在良好的医学判断范围内，那些适
用于与人类和动物组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或任何其它问题或并发症、与合理的风险/收益关系成正比的化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0045]
·
如本文件中所用，表述“药学上可接受的媒介物”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如填充材料、稀释剂、赋形剂或液体或固体溶剂，其参与将目标化合物从一个器官或身体的一部分运输或转运至另一个器官或身体的一部分。在与制剂的其它组分相容且不对患者造成伤害的意义上，媒介物必须是“可接受的”。
[0046]
·
术语“其包含”是指其包括但不限于词语“其包含”之后的内容。因此，术语“其包含”的使用表示所列出的元素是强制性的或命令性的，但是其它元素是任选的并且可以存在或可以不存在。
[0047]
·“其包括”应理解为意指其包括并限于短语“其包括”之后的内容。因此，短语“其包括”表示所列出的元素是强制性的，并且其它元素可以不存在。
[0048]
·“治疗剂”在本发明中应理解为意指任何能够在癌症的治疗中具有治疗作用的化学或生物分子，例如溶瘤病毒、活性蛋白或非蛋白成分等。
附图说明
[0049]
图1.绘示获得根据本发明的msc的过程的示意图，msc的特征在于mavs基因(或其它由所述基因调控的基因)的表达被抑制，或mavs蛋白不表达。
[0050]
图2.通过ann分析对病毒的免疫反应过程的差异表达基因的相对表达(mavs，p≤0.001；ndrg1，p≤0.0116)。
[0051]
图3.定量celyvir培养物上清液中差异分泌的蛋白的定量。在所分析的五种蛋白中，使用多重测定仅检测到il-6和mcp-1(p≤0.05)。
[0052]
图4.拟建模型的图形说明。
具体实施方式
[0053]
实例1.材料和方法
[0054]
实例1.1.研究设计
[0055]
celyvir是一种用自体间充质细胞和溶瘤腺病毒icovir-5生产的先进治疗药品(atmp)。变异性与atmp的细胞的个体和内在特征相关联，这可能会影响药剂的质量，转而又可能影响临床反应。如图1所示，对第一患者群组施用的不同celyvir产品的这些生物学特征进行了详尽的研究。使用对生物系统的近似分析，确定在对治疗有反应的患者和没有反应的患者之间起不同作用的生物程序。此外，鉴定了导致所述差异的分子。这些候选物在接受celyvir治疗的第二患者群组中得到验证。
[0056]
实例1.2.从患者获得间充质细胞
[0057]
通过从患者的髂嵴抽吸骨髓获得msc。通过菲科梯度离心(ficoll-paque
tm plus,通用电气医疗集团(ge healthcare))在20℃下以1500rpm离心20分钟获得单核细胞。使用pasteur移液管将离心后获得的单核细胞层与梯度的剩余组分分离。将细胞转移到干净的falcon管中并用gibco的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤。在以1500rpm最后一次离心5分钟后，将单核细胞重悬于培养基中。
[0058]
实例1.3.来自患者的间充质细胞的培养
[0059]
初始单核部分用杜氏改良依格尔培养基(dmem 1g/l葡萄糖，gibco，加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad，ca))以500,000细胞/cm2的表面密度培养，该培养基补充有先前在湿浴中于56℃灭活20分钟的10％胎牛血清(fbs，hyclone，犹他州洛根(logan，ut))，和1％青霉素-链霉素(p/s，gibco)。48小时后更换培养基，这有足够的时间让msc粘附到塑料上，而其余的单核细胞仍悬浮在培养基中。第一次更换后，每3至5天更换一次培养基。
[0060]
将msc保持在37℃和5％co2的气氛中直到达到足够的汇合水平(约80％)。在胰蛋白酶消化时，细胞用pbs洗涤一次，然后向其中加入胰蛋白酶(triple express，生命科技公司(life technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。使用新鲜培养基和移液管收集从塑料表面脱离的细胞，并以1500rpm离心5分钟以去除胰蛋白酶。将获得的msc沉淀重悬于新鲜培养基中，并以3000至5000个细胞/cm2重新接种细胞。
[0061]
在第三或第四次细胞传代中，msc通过流式细胞术进行表征。
[0062]
实例1.4.icovir-5溶瘤腺病毒
[0063]
icovir-5的特征已由其发明人描述(alonso mm、cascallo m、gomez-manzano c、jiang h、bekele bn、perez-gimeneza等人，“icovir-5在体内呈现e2f1成瘾和强效抗神经胶质瘤作用(icovir-5shows e2f1 addiction and potent antiglioma effect in vivo.)”《癌症研究(cancer res)》2007；67:8255-8263)。对于这项研究，它是在巴塞罗那大学的载体生产部门中生产的。
[0064]
实例1.5.celyvir制备
[0065]
人用药剂的制备符合良好生产规范(gmp)标准，并且目前的团队已经描述了其对患者的施用(melen gj、franco-luz
ó
n l、ruano d、gonz
á
lez-murilloalfrancaa、casco f等人，载体细胞对用间充质干细胞中递送的高剂量溶瘤腺病毒治疗的患有成神经细胞瘤的儿童的临床结局的影响(influence of carrier cells on the clinical outcome of children with neuroblastoma treated with high dose of oncolytic adenovirus delivered in mesenchymal stem cells.)《癌症快报(cancer letters)》2016；371:161-170)。
[0066]
实例1.6.celyvir转录组研究(rna测序)
[0067]
对于转录组研究，使用从中除去上清液的celyvir培养物的细胞级分。使用绝对rna微量制备试剂盒(absolutely rnamicroprep kit)(安捷伦(agilent)，加利福尼亚州圣克拉拉(santa clara，ca))提取rna，并且每个样品用dnasa处理以避免dna污染。将来自每个样品的3μg的rna送到进行大规模测序的马德里科学园(madrid science park)的大规模测序单元(massive sequencing unit)。获得的原始数据用于后续的统计分析。
[0068]
实例1.7.在转录组分析中获得的结果的验证
[0069]
使用qpcr验证转录组结果
[0070]
为了验证通过生物信息学分析鉴定的候选基因，使用taqman技术(应用生物系统公司(applied biosystems)，加利福尼亚州福斯特市(foster city，ca))对来自患者群组的celyvir样品进行定量pcr，该患者群组独立于在鉴定过程期间使用的初始群组(反应者，n＝5；无反应者，n＝10)。
[0071]
表1示出了所使用的应用生物系统公司测定。
[0072]
表1
[0073][0074]
qpcr反应使用taqman基因表达预混液(应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特市)进行，并且pcr反应的元素的比例如表2所示，最终体积为20μl：
[0075]
表2
[0076][0077]
luminex对分泌蛋白组候选物的量化
[0078]
为了在功能上验证在先前段落中确定的基因的结果，使用luminex xmap技术对来自患者群组的celyvir上清液中的一些蛋白的水平进行量化，该患者群组独立于在鉴定过程期间使用的初始群组(反应者，n＝5；无反应者，n＝10)。为此，根据制造商的说明，使用以下luminex xmap测定：
[0079]
·
milliplex map人细胞因子/趋化因子磁珠组(hcytomag-60k，默克公司(merck)，emd密理博公司(emd millipore corporation)，马萨诸塞州比勒利卡(billerica，ma))，用于测定白细胞介素4(il-4)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素10(il-10)和mcp-1(ccl2)。
[0080]
·
milliplex map人可溶性细胞因子受体组(hscrmag-32k，默克公司，emd密理博公司，马萨诸塞州比勒利卡)，用于测定白介素受体6(il-6r)。
[0081]
使用设备(emd密理博公司，马萨诸塞州比勒利卡)对板进行分析，并使用magpix xponent软件(emd密理博公司，马萨诸塞州比勒利卡)对结果进行解释。
[0082]
实例2结果
[0083]
实例2.1.转录组分析
[0084]
使用常规统计分析处理来自转录组的数据以鉴定反应者和无反应者的msc之间差异表达更大的基因。以一次近似，考虑两组基因：那些显示出误差水平为1％的显著统计富集的基因(p《0.01)和那些已应用较少限制性标准(p《0.05)以产生潜在有趣结果的更广泛列表的基因。进行三项统计学检验(anova、wilcoxon和t-学生)以评价有反应的患者和无反应的患者之间基因表达的统计学显著差异。在校正后的多重测试之后获得以下阳性结果(fdr《0.05)：只有15个结果，并且只有那些源自anova测试的结果。表3示出以一次近似显示有反应的患者和无反应的患者组之间显著差异的候选基因。
[0085]
表3
[0086][0087]
由于统计学上的限制性较小，对于所进行的三个测试中的至少一个，总共有113个基因显示出显著的未校正p-值(p-值《0.01)。
[0088]
实例2.2.基因集富集分析(gsea)
[0089]
将上述数据上传到gsea平台以确定对使用celyvir的疗法有反应的患者和对使用celyvir的疗法没有反应的患者的msc之间的差异分子途径和过程。这种近似提供了一个有序的基因列表，其中差异越显著，所述列表中的位置越高。在这种情况下，用于对所述基因进行分类的参数是发射的信号和每个样品的背景信号之间的比率。那些在所有样品中均具有背景信号的样品被排除在gsea之外。根据这些标准，转化了信噪比参数中13,715个基因的表达水平。总共有5601个基因被排除在分析之外，因为在任何样品中都没有检测到信号。
[0090]
在对celyvir有反应的患者群组中发现81条显著富集的途径，而在无反应的患者群组发现59条途径。
[0091]
gsea提供的最相关的过程和途径是：
[0092]
1.病毒感染和核酸的代谢。gsea结果表明，与无反应者相比，有反应的患者群组中参与这些过程的基因的表达增加。一些与核酸相关的过程表现为代表有反应的患者群组，包括与用于调控脱氧核糖核酸(dna)转录、dna复制、dna-核糖核酸(rna)相互作用、核糖体rna、rna剪接和翻译的机制相关的基因组。另外，直接涉及病毒生物学(宿主细胞对病毒释放的正调控、病毒生命周期)的基因组在有反应的患者的样品中出现过表达。
[0093]
2.与免疫反应有关的过程。这些过程在两个患者群组的msc中似乎都出现增加。然而，这种类型的过程类别因群组而异。有反应的患者表现出与ifnγ有关的途径的富集，以及与t细胞生物学有关的过程；已知这两个过程都构成抗病毒反应机制。在无反应的患者的情况下，存在更多与吞噬能力有关的过程。类似地，这组患者表现出数量增加/丰度更高的免疫细胞迁移过程。这些过程(血细胞渗出、单核细胞粘附、白细胞外渗等)大多数含有pecam1，其似乎在无反应的患者的所有样品中都有表达。无反应的患者也表现出与血管通透性增加有关的蛋白表达增加。
[0094]
3.msc调控信号转导途径。在两个患者群组中，在与msc迁移的负调控和正调控相关联的途径中检测到差异。这些途径包括hgf信号转导、速激肽信号转导、hippo信号转导、notch信号转导、wnt信号转导和mapk信号转导途径。
[0095]
4.细胞-细胞粘附。两个患者群组均表现出与细胞-细胞粘附有关的基因组差异：桥粒和沟通交流中的反应者；而无反应的患者主要表现出与细胞骨架重组有关的过程。
[0096]
5.有丝分裂。与无反应的患者的msc相比，大量与有丝分裂有关的基因组在有反应的患者的msc中出现过表达。进一步地，来自无反应的患者的样品显示出定义干细胞增殖调控的基因集的过表达。
[0097]
6.代谢。两个患者群组均表现出与代谢，主要是糖原、蛋白和脂质代谢有关的基因的差异。两组患者均表现出糖原代谢增加，这要么通过直接分解代谢(主要由agl表示，其在有反应的患者中一致表达，但在无反应者中不一致表达)发生，要么通过无反应者中糖原生成的负调控发生。有反应的患者的样品显示出与蛋白代谢有关的基因的富集，包括肽酶活性和肽和氨基酸的代谢。另一方面，无反应的患者表现出与脂质代谢(类异戊二烯产生以及脂肪酸和脂蛋白的调控和产生)有关的基因增加。
[0098]
7.应激反应。两组患者均表现出与应激反应有关的确定途径增加(细胞器应激反应；磷酸化诱导的dna损伤、dna损伤反应的调控和内质网应激)。
[0099]
8.骨髓纤维化。当与有反应的患者相比时，无反应的患者的样品表现出与骨髓纤维化有关的基因的富集，包括血管生成因子(vegfa、vegfb、pdgfa)、促炎细胞因子(il 1a和il 1b)和细胞外基质重塑因子(mmp14)。
[0100]
接下来，对有反应的患者和无反应的患者的msc的分泌蛋白组中差异表达的蛋白是否形成似乎在gsea中富集的过程的一部分作出评价(p-值《0.01)。在这方面，可以看出127个候选物中有27个候选物参与了富集基因集中的至少一个(有反应的患者中81人中有12人，无反应的患者中59人中有9人)。有反应的患者和无反应的患者之间总共17种在msc分泌蛋白组中差异表达的蛋白形成有反应的患者样品中富集蛋白集的一部分。然而，差异表达并存在于两个患者组的分泌蛋白组中的15种蛋白在无反应的患者中形成富集蛋白集的一部分。
[0101]
实例2.3.生物系统近似分析
[0102]
一次分析或近似的目的仅仅是鉴定那些在每个患者组中以更高或更低强度表达的基因或蛋白。接下来，对可能与celyvir的功效或活性最相关的过程进行更深入的分析：那些与对病毒的免疫反应和病毒复制相关的过程。为此，使用生物系统和人工神经网络(ann)的数学分析对候选物进行评价。
[0103]
ann模型评价所生成的网络或矩阵内的区域集(在目前情况下，基因和/或蛋白)之间存在的关系，提供预测评分，其量化所评价的区域(在目前情况下，所评价的基因/蛋白集)之间存在功能关系或连接的概率。每个评分均与p-值相关联，该p-值指示结果具有统计显著性的概率。根据p-值的值，定义具有以下关系的蛋白组：
[0104]
·
如果蛋白集与任何用于表征的子过程具有强或中等-强预测关系，则与当时研究的过程具有强关系(p-值《0.05)。
[0105]
·
如果所述过程与任何用于表征的子过程具有至少中间值关系，则与当时研究的过程具有中间关系(p-值《0.075至0.25)。
[0106]
·
如果所述过程与表征中使用的其余子过程具有弱或不存在关系，则与当时研究的过程具有弱或不存在关系(p-值《0.25)。
[0107]
鉴于很大的程度的充分分析，仅详述上述两个过程获得的最相关的结果。
[0108]
实例2.4.在转录组分析中获得的差异基因
[0109]
在来自有反应的患者和无反应的患者的用溶瘤腺病毒icovir-5感染的msc的转录组中检测到的总共44个差异表达的基因显示出与以下过程有强关系：
[0110]
·
对病毒的免疫反应(29种蛋白)
[0111]
·
病毒复制(26种蛋白)
[0112]
对于病毒的免疫反应过程，总共有五种编码相同数量蛋白的基因与参与这一整个过程的至少三个不同的子过程强相关：traf3、mavs、pcbp2、fasn和ndrg1(表4)。表4示出了患者对病毒的免疫反应过程的差异表达的基因。出现在列表中的基因显示出与所述过程有强关系。从左到右详述的是基因的名称；其在有反应的患者组中的丰度；如果所述基因在所描述的过程中具有效应剂作用；ann分析评分的值；以及最后，所述基因干预的特定子过程的描述。
[0113]
表4
[0114][0115]
对于病毒复制过程，总共有八个编码相同数量蛋白的基因与参与这一整个过程的至少两个子过程强相关：chmp2a、clec5a、xbp1、bmpr1b、mavs、rab29、traf3和memo1(表5)。表5示出了患者对病毒复制过程的差异表达的基因。出现在列表中的基因显示出与所述过程有强关系。从左到右详述的是基因的名称；其在有反应的患者组中的丰度；如果所述基因在所描述的过程中具有效应剂作用；ann分析评分的值；以及最后，所述基因干预的特定子过程的描述。
[0116]
表5
depend on mavs but involve neither the nlrp3 inflammasome nor jnk and p38 signaling pathways.)”《病毒研究(virus res)》2015；208:89-97)(roe k、giordano d、young lb、draves ke、holder u、suthar ms等人，“树突状细胞相关联的mavs需要控制西尼罗病毒复制和随后的体液免疫反应(dendritic cell-associated mavs is required to control west nile virus replication and ensuing humoral immune responses.)”《公共科学图书馆期刊(plos one)》2019；14:e0218928)(vazquez c、horner sm，“抗病毒先天免疫的mavs协调(mavs coordination ofantiviral innate immunity.)”《病毒学杂志(j virol)》2015；89:6974-6977)，但就目前所知，这是首次描述和证实mavs在间充质细胞中的调控作用。
[0125]
总之，这两种基因和这两种蛋白在有反应的患者中的低表达(由经由第一种的较低信号转导产生)表明icovir-5的细胞内存在的信号转导较低或信号转导延迟，免疫反应介体的产生显著较少。在任何情况下，有反应的患者的msc都表现出免疫系统的刺激不足，使得所述免疫系统产生抗病毒反应，因此产生对celyvir的免疫反应。这允许间充质细胞迁移到肿瘤部位，而在icovir-5在msc内部复制时不被患者的免疫系统中和。假设的图形说明如下所示(图4)。