一种基于长链非编码RNA的鉴定骨髓间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒的制作方法

本发明属于基因检测领域，涉及一种鉴定间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒。

背景技术：

间充质干细胞中最热门、最具前景的当属骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞。

近年来液氮冷冻保存骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞技术得到广泛应用。然而液氮冻存细胞的缺点是其极易挥发，长期冻存会造成液氮消耗，必须及时补充。因此，很多研究机构都采用-80℃对骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞进行冻存保护(不超过12个月)。

但是，-80℃冻存时间对骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞生物学特性及增殖活力的影响还未有统一定论。一般而言，根据文献及长期研究经验，-80℃冻存1～6个月基本不会明显影响骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞的生物学特性及增殖活力，而-80℃冻存7～12个月的骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞的细胞核和细胞质稳定性会变差，增殖能力和分化能力会受到较大影响，造成实验重复性差(参考文献：低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响，军医进修学院学报，2012年第33卷第11期；骨髓间充质干细胞在-80℃低温条件下的冻存，中国组织工程研究，2016年第20卷第10期)。因此，研究者通常选用-80℃冻存1～6个月内的骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞作为种子细胞进行研究。

但是，现有技术存在如下不足：

第一，实验室于-80℃冰箱冻存作为种子细胞的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞常常因标签损坏而无法确定该骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞的冻存时间；

第二，虽然可以将骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞复苏后，通过测定其增殖活力和表型大概判断该细胞的冻存时间，但该方法先要将冻存的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞复苏，然后体外培养，再测试其增殖活力和表型，耗时费力。

本发明旨在提供一种解决上述不足的技术方案，以鉴定骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞冻存时间，同时不需要对冻存的细胞进行复苏即可操作。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种鉴定骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒，以快速确定待测冻存骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞是冻存1～6月还是冻存7～12月的骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞。

上述目的通过如下技术方案实现：

骨髓间充质干细胞-长链非编码RNA

一种基于长链非编码RNA的鉴定骨髓间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒，包括用于测定LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B和LncRNA AK043773表达水平的qPCR引物；所述鉴定骨髓间充质干细胞冻存时间指鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞。

优选地，所述测定LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B和LncRNA AK043773表达水平指测定LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B和LncRNA AK043773相对于内参U6的相对表达水平。

LncRNA AK046999的qPCR上游引物为5'-TCTAAGAGTTTCGGCGAGCACCT-3'；

LncRNA AK046999的qPCR下游引物为5'-TACACCATGCTACGACTGGTTTG-3'。

LncRNA CDKN2B的qPCR上游引物为5'-GTATCCTACATCAGATGAGTCTG-3'；

LncRNA CDKN2B的qPCR下游引物为5'-GGCATTCGTATACAATAGTCGTA-3'。

LncRNA AK043773的qPCR上游引物为5'-GCAATCTTGTACGATACGAGGCTG-3'；

LncRNA AK043773的qPCR下游引物为5'-GATTGACCAGTATGTAACCTAGGC-3'。

内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'；

内参U6的qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

骨髓间充质干细胞-微小RNA

一种基于微小RNA的鉴定骨髓间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒，包括用于测定hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p和hsa-miR-635表达水平的qPCR引物；鉴定骨髓间充质干细胞冻存时间指鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞。

优选地，所述测定hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p和hsa-miR-635表达水平指测定hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p和hsa-miR-635相对于内参U6的相对表达水平。

hsa-miR-505-5p的qPCR上游引物为5'-TGTCCTACGCCATGCGCATATAAAG-3'；

hsa-miR-505-5p的qPCR下游引物为5'-AGTAACTAAGCGGCAGATGAATGG-3'。

hsa-miR-197-5p的qPCR上游引物为5'-TGTTTGACTTCACTGTGCCTCTGTTG-3'；

hsa-miR-197-5p的qPCR下游引物为5'-CACAATGGTTGTGGCTCGAACTGTG-3'。

hsa-miR-635的qPCR上游引物为5'-CTTCAAGACTAGAAAGTGACACCT-3'；

hsa-miR-635的qPCR下游引物为5'-TGCGCTAGGGGCGAGCAGTAGTG-3'。

内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'；

内参U6的qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

骨髓间充质干细胞-环状RNA

一种基于环状RNA的鉴定骨髓间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒，包括用于测定hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037和hsa_circ_0057635表达水平的qPCR引物；所述鉴定骨髓间充质干细胞冻存时间指鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞。

优选地，测定hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037和hsa_circ_0057635表达水平指测定hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037和hsa_circ_0057635相对于内参U6的相对表达水平。

hsa_circ_0042254的qPCR上游引物为5'-GCAACTGCTTTATGAACACAAGGA-3'；

hsa_circ_0042254的qPCR下游引物为5'-GACTCCACCACGTGTCATGGGCAA-3'。

hsa_circ_0033037的qPCR上游引物为5'-ACCATGCGAATCTGAGGTCTACAAGT-3'；

hsa_circ_0033037的qPCR下游引物为5'-CCTAGCATTAGCATGTATCCAACGTG-3'。

hsa_circ_0057635的qPCR上游引物为5'-GACTTACTCGTGGTAATGACATGA-3'；

hsa_circ_0057635的qPCR下游引物为5'-AACTCACTCAGTCGATCCATGCTA-3'。

内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'；

内参U6的qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

脐带间充质干细胞-长链非编码RNA

一种基于长链非编码RNA的鉴定脐带间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒，包括用于测定LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265和LncRNA LINC00152表达水平的qPCR引物；所述鉴定脐带间充质干细胞冻存时间指鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞。

优选地，所述测定LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265和LncRNA LINC00152表达水平指测定LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265和LncRNA LINC00152相对于内参U6的相对表达水平。

优选地，LncRNA LINC01001的qPCR上游引物为5'-TAGTGAGATTCGCTCTCGTGG-3'，qPCR下游引物为5'-TGCAGATCTCGTGCTTGCTTT-3'。

LncRNA LINC00265的qPCR上游引物为5'-TGAGTCAATGCAAGGCTGATAGG-3'，qPCR下游引物为5'-CGTCTGACTCATGACGTAGGAAC-3'。

LncRNA LINC00152的qPCR上游引物为5'-TCTAATGCAGAGATAATGCTGGC-3'，qPCR下游引物为5'-ACAGGACACCAACAGACATGG-3'。

优选地，内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'，qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

脐带间充质干细胞-微小RNA

一种基于微小RNA的鉴定脐带间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒，包括用于测定hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p和hsa-miR-219b-3p表达水平的qPCR引物；所述鉴定脐带间充质干细胞冻存时间指鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞。

优选地，所述测定hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p和hsa-miR-219b-3p表达水平指测定hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p和hsa-miR-219b-3p相对于内参U6的相对表达水平。

优选地，hsa-miR-615-3p的qPCR上游引物为5'-CACGTTGCTACATGGTACGAAC-3'，qPCR下游引物为5'-AAGAACAGAGTGTGGTACACG-3'。

优选地，hsa-miR-455-5p的qPCR上游引物为5'-GTTGATAGAGAGGTGTGACGTG-3'，qPCR下游引物为5'-CGAGCCAGAACGATAATAGTCT-3'。

优选地，hsa-miR-219b-3p的qPCR上游引物为5'-GATCCTTCTGGTAGTGGACGG-3'，qPCR下游引物为5'-TGCCGGTCTGACTTGTCTTCG-3'。

优选地，内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'，qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

脐带间充质干细胞-环状RNA

一种基于环状RNA的鉴定脐带间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒，包括用于测定hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703和hsa_circ_0023538表达水平的qPCR引物；所述鉴定脐带间充质干细胞冻存时间指鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞。

优选地，测定hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703和hsa_circ_0023538表达水平指测定hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703和hsa_circ_0023538相对于内参U6的相对表达水平。

hsa_circ_0012332的qPCR上游引物为5'-GATGCTGTTCCCAAGAAACCTGAA-3'，qPCR下游引物为5'-CTTAAATGCTGACTGGTCAGTAACT-3'。

hsa_circ_0083703的qPCR上游引物为5'-CGTGACCGATTGACCATACATTGAG-3'，qPCR下游引物为5'-GTGAACTCCAGCTTAACAGGTCTA-3'。

hsa_circ_0023538的qPCR上游引物为5'-TACACTGAAGGTGTGCCAATTACA-3'，qPCR下游引物为5'-ACATCTAGGAGCACTGTCAGGAGT-3'。

优选地，内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'，qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

本发明提供的基因检测试剂盒具有如下优点：

第一，实验室于-80℃冰箱冻存作为种子细胞的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞常常因标签损坏而无法确定该骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞的冻存时间，通过本发明试剂盒可以测定该人骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞属于冻存1～6月还是冻存7～12月的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞；

第二，可以直接以冻存的间充质干细胞进行分析检测，无需解冻复苏，简单、高效。

附图说明

图1为LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的ROC曲线；

图2为hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的ROC曲线；

图3为hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的ROC曲线；

图4为LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的ROC曲线；

图5为hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的ROC曲线；

图6为hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。

实施例1：鉴定骨髓间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒

一、实验材料

L-DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司。RNA提取试剂盒TRIzol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，qPCR试剂购自Vazyme公司。

二、实验方法

1、骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、传代及冻存

无菌抽取健康志愿者的骨髓液5ml并肝素化，与等量体积、含10％胎牛血清的L-DMEM培养液混匀，置于ficoll分离液(比重1.077)上，2000r/min离心20min，离心后可见混合液从上至下共分四层：最上层淡黄色的为血清；第二层为菲薄的白膜层即单个核细胞；第三层为无色透明的淋巴细胞分离液；最底层为红细胞层。收集白膜层中的单个核细胞，以含10％胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞并进行计数，以1×10⁶/ml的密度接种于50ml的培养瓶中，置于37℃、体积分数5％的CO2培养箱孵育。24h后全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞，此后隔天进行半量换液，即为原代(P0)骨髓间充质干细胞。

待原代培养细胞贴培养瓶底面积达60％～70％左右时，吸尽培养基并用PBS洗涤1次，加入37℃预温的0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA各0.5ml混合消化细胞，约3min后镜下可见细胞收缩变短、间隙增大，加入含10％胎牛血清的L-DMEM终止消化。用吸管轻轻吹打直至贴壁细胞悬浮，吸取细胞悬液，1000r/min离心5min，洗涤2次。最后用10％胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，分别接种于两瓶50ml的培养瓶中，此时的细胞称为P1代细胞。同法进行以后各代细胞的传代培养直至传至P3代。将P3代骨髓间充质干细胞分别分装于1.5ml细胞冻存管-80℃冻存1～12月，每月若干管，标号，备用。

2、总RNA提取和目标RNA相对表达水平测定

将冻存管从液氮中取出，按照冻存细胞直接提取RNA的方法用RNA提取试剂盒TRIzol提取总RNA，NanoDrop ND-1000测定260nm/280nm吸光度比值范围1.8～2.0。

以U6作为内参，根据逆转录试剂盒、qPCR试剂使用说明书采用qPCR法检测各样本中目标RNA的相对表达水平，结果采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。

目标RNA及内参U6的qPCR引物如下表所示。

3、数据分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均值±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以M(QR)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料比较采用Fisher's确切概率法。

采用二元Logistic回归分析计算LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773联合的Logistic回归方程；绘制LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773及其联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用二元Logistic回归分析计算hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635联合的Logistic回归方程；绘制hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635及其联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用二元Logistic回归分析计算hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635联合的Logistic回归方程；绘制hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635及其联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773及其联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的价值

随机选取冻存1～6月骨髓间充质干细胞每月各20管测定结果和冻存7～12月骨髓间充质干细胞每月各20管测定结果作为训练集；另随机选取冻存1～6月骨髓间充质干细胞每月各20管测定结果和冻存7～12月骨髓间充质干细胞每月各20管测定结果作为验证集。

训练集中，LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773在冻存7～12月骨髓间充质干细胞中的相对表达量比在冻存1～6月骨髓间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3～4倍。LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC分别为0.628、0.685、0.677。以骨髓间充质干细胞代数为因变量(赋值：冻存1～6月＝0，冻存7～12月＝1)，LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-2.172+4.833×LncRNA AK046999+5.074×LncRNA CDKN2B+4.565×LncRNA AK043773，其鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC为0.921，截断值为2.886(ROC曲线见图1)。LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC显著大于LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773单独鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为冻存7～12月骨髓间充质干细胞，低于截断值的预测为冻存1～6月骨髓间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为92.08％。

2、hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635及其联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的价值

随机选取冻存1～6月骨髓间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月骨髓间充质干细胞每月各20管作为训练集；另随机选取冻存1～6月骨髓间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月骨髓间充质干细胞每月各20管作为验证集。

训练集中，hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635在冻存7～12月骨髓间充质干细胞中的相对表达量比在冻存1～6月骨髓间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3～4倍。hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC分别为0.646、0.659、0.653。以骨髓间充质干细胞代数为因变量(赋值：冻存1～6月＝0，冻存7～12月＝1)，hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-3.144+5.138×hsa-miR-505-5p+5.569×hsa-miR-197-5p+4.147×hsa-miR-635，其鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC为0.918，截断值为3.073(ROC曲线见图2)。hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC显著大于hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635单独鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为冻存7～12月骨髓间充质干细胞，低于截断值的预测为冻存1～6月骨髓间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为90.83％。

3、hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635及其联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的价值

随机选取冻存1～6月骨髓间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月骨髓间充质干细胞每月各20管作为训练集；另随机选取冻存1～6月骨髓间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月骨髓间充质干细胞每月各20管作为验证集。

训练集中，hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635在冻存7～12月骨髓间充质干细胞中的相对表达量比在冻存1～6月骨髓间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3.2～4.2倍。hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC分别为0.702、0.671、0.686。以骨髓间充质干细胞代数为因变量(赋值：冻存1～6月＝0，冻存7～12月＝1)，hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-2.759+5.812×hsa_circ_0042254+6.303×hsa_circ_0033037+4.909×hsa_circ_0057635，其鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC为0.929，截断值为3.295(ROC曲线见图3)。hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635联合鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC显著大于hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635单独鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为冻存7～12月骨髓间充质干细胞，低于截断值的预测为冻存1～6月骨髓间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为92.50％。

4、鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的试剂盒

一种鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的试剂盒，含有LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。LncRNA AK046999、LncRNA CDKN2B、LncRNA AK043773、内参U6的qPCR引物如下表所示。

一种鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的试剂盒，含有hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。hsa-miR-505-5p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-635、内参U6的qPCR引物如下表所示。

一种鉴定区分冻存1～6月骨髓间充质干细胞和冻存7～12月骨髓间充质干细胞的试剂盒，含有hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。hsa_circ_0042254、hsa_circ_0033037、hsa_circ_0057635、内参U6的qPCR引物如下表所示。

实施例2：鉴定脐带间充质干细胞冻存时间的基因检测试剂盒

一、实验材料

DMEM/F12培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司。RNA提取试剂盒TRIzol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，qPCR试剂购自Vazyme公司。

二、实验方法

1、脐带间充质干细胞的体外分离、培养及连续传代

①消化：取8cm左右脐带组织(来自健康足月剖宫产的新生儿)，用无菌PBS洗涤去除残血，剪成约1mm×1mm×1mm大小，经0.15％胶原酶Ⅱ，37℃温育消化4h，200目筛网过滤，收集细胞并用锥虫蓝染色计数活细胞数。②贴壁分离：将细胞悬浮于含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养液，接种到T25培养瓶中，控制接种细胞浓度为2.4×10⁴/cm²，置37℃、体积分数为5％CO2培养箱中，饱和湿度培养3d后全量换液，继续培养并观察细胞生长情况(此细胞即为原代脐带间充质干细胞P0)。③传代：当培养细胞达到90％融合时，用消化液(0.25％胰酶-0.01％EDTA溶液)处理约3min、离心、弃上清、沉淀细胞用完全培养液重悬并用锥虫蓝计数，接种于新的T25培养瓶中，控制接种细胞浓度为2.4×10⁴/cm²，置CO2培养箱中继续培养并观察细胞生长情况，此细胞即为P1代细胞。同法进行以后各代细胞的传代培养。将P3代脐带间充质干细胞分别分装于1.5ml细胞冻存管-80℃冻存1～12月，每月若干管，标号，备用。

2、总RNA提取和目标RNA相对定量测定

将冻存管从液氮中取出，按照冻存细胞直接提取RNA的方法用RNA提取试剂盒TRIzol提取总RNA，NanoDrop ND-1000测定260nm/280nm吸光度比值范围1.8～2.0。

以U6作为内参，根据逆转录试剂盒、qPCR试剂使用说明书采用qPCR法检测各样本中目标RNA的相对表达水平，结果采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。

目标RNA及内参U6的qPCR引物如下表所示。

3、数据分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均值±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以M(QR)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料比较采用Fisher's确切概率法。

采用二元Logistic回归分析计算LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152联合的Logistic回归方程；绘制LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152及其联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用二元Logistic回归分析计算hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p联合的Logistic回归方程；绘制hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p及其联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用二元Logistic回归分析计算hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538联合的Logistic回归方程；绘制hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538及其联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152及其联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的价值

随机选取冻存1～6月脐带间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月脐带间充质干细胞每月各20管作为训练集；另随机选取冻存1～6月脐带间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月脐带间充质干细胞每月各20管作为验证集。

训练集中，LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152在冻存7～12月脐带间充质干细胞中的相对表达量比在冻存1～6月脐带间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3～4倍。LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC分别为0.680、0.693、0.678。以脐带间充质干细胞代数为因变量(赋值：冻存1～6月＝0，冻存7～12月＝1)，LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-3.410+4.055×LncRNA LINC01001+4.172×LncRNA LINC00265+3.992×LncRNA LINC00152，其鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC为0.909，截断值为2.718(ROC曲线见图4)。LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC显著大于LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152单独鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为冻存7～12月脐带间充质干细胞，低于截断值的预测为冻存1～6月脐带间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为90.42％。

2、hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p及其联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的价值

随机选取冻存1～6月脐带间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月脐带间充质干细胞每月各20管作为训练集；另随机选取冻存1～6月脐带间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月脐带间充质干细胞每月各20管作为验证集。

训练集中，hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p在冻存7～12月脐带间充质干细胞中的相对表达量比在冻存1～6月脐带间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3～4倍。hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC分别为0.686、0.713、0.695。以脐带间充质干细胞代数为因变量(赋值：冻存1～6月＝0，冻存7～12月＝1)，hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-4.144+5.975×hsa-miR-615-3p+6.344×hsa-miR-455-5p+5.324×hsa-miR-219b-3p，其鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC为0.915，截断值为2.803(ROC曲线见图5)。hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC显著大于hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p单独鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为冻存7～12月脐带间充质干细胞，低于截断值的预测为冻存1～6月脐带间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为91.25％。

3、hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538及其联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的价值

随机选取冻存1～6月脐带间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月脐带间充质干细胞每月各20管作为训练集；另随机选取冻存1～6月脐带间充质干细胞每月各20管和冻存7～12月脐带间充质干细胞每月各20管作为验证集。

训练集中，hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538在冻存7～12月脐带间充质干细胞中的相对表达量比在冻存1～6月脐带间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3.5～4.5倍。hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC分别为0.725、0.694、0.708。以脐带间充质干细胞代数为因变量(赋值：冻存1～6月＝0，冻存7～12月＝1)，hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-3.797+6.181×hsa_circ_0012332+7.144×hsa_circ_0083703+6.291×hsa_circ_0023538，其鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC为0.930，截断值为3.045(ROC曲线见图6)。hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538联合鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC显著大于hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538单独鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为冻存7～12月脐带间充质干细胞，低于截断值的预测为冻存1～6月脐带间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为93.75％。

4、鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的试剂盒

一种鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的试剂盒，含有LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。LncRNA LINC01001、LncRNA LINC00265、LncRNA LINC00152、内参U6的qPCR引物如下表所示。

一种鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的试剂盒，含有hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。hsa-miR-615-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-219b-3p、内参U6的qPCR引物如下表所示。

一种鉴定区分冻存1～6月脐带间充质干细胞和冻存7～12月脐带间充质干细胞的试剂盒，含有hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。hsa_circ_0012332、hsa_circ_0083703、hsa_circ_0023538、内参U6的qPCR引物如下表所示。

上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。