一种基于环状RNA的鉴定脐带间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒的制作方法

本发明属于基因检测领域，涉及一种鉴定间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒。

背景技术：

间充质干细胞中最热门、最具前景的当属骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞。

人骨髓内间充质干细胞含量稀少，且随着年龄增加或体质衰弱细胞数量会逐渐减少，因此进行大量扩增非常必要，但目前关于扩增后各代骨髓间充质干细胞的生物学特性是否相同仍无准确定论。在常规培养条件下人骨髓间充质干细胞能生长10代左右，结合文献公开资料以及实验经验，1～5代增殖特性和细胞活力明显优于6～10代(参考文献：人骨髓间充质干细胞的体外连续传代及鉴定，广西中医学院学报，2012年第15卷第1期；比较不同传代人骨髓间充质干细胞的生物学特性，中国组织工程研究与临床康复，2009年第13卷第49期)。

人脐带间充质干细胞源于胚胎发育早期中胚层，具有良好的多能性，在体外诱导可分化成脂肪、软骨、神经细胞和肝细胞等多种细胞。人脐带间充质干细胞比人骨髓内间充质干细胞具有更好的分裂传代能力，一般而言，研究人员可以接受1～20代内人脐带间充质干细胞用作研究的种子细胞。结合文献公开资料以及实验经验，1～10代增殖特性、细胞活力和染色体稳定性明显优于11～20代(参考文献：长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性，中国组织工程研究与临床康复，2011年第15卷第10期；脐带间充质干细胞体外传代培养后细胞核型稳定性，贵阳医学院学报，2013年第38卷第5期；人脐带间充质干细胞体外传代遗传特性的研究，现代医学，2015年第43卷第9期)。

为了获得较好的实验结果，保证实验的可重复性，研究人员通常优选1～5代骨髓间充质干细胞或1～10代人脐带间充质干细胞作为研究细胞。但是，现有技术存在如下不足：

第一，市面上购买到的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞到底是第几代无法确证，商家标示信息不可信，作为种子细胞重复性差；

第二，实验室自己冻存作为种子细胞的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞常常因标签损坏而无法确定该骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞的代数；

第三，虽然可以将购买或自行留存的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞复苏后，通过测定其增殖活力和表型大概判断该细胞的代数，但该方法先要将冻存的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞复苏，然后体外培养，再测试其增殖活力和表型，耗时费力。

本发明旨在提供一种解决上述不足的技术方案，以鉴定骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞传代次数，同时不需要对冻存的细胞进行复苏即可操作。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种鉴定骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒，以快速确定待测冻存骨髓间充质干细胞是1～5代还是6～10代骨髓间充质干细胞，或快速确定待测冻存脐带间充质干细胞是1～10代还是11～20代脐带间充质干细胞。

上述目的通过如下技术方案实现：

骨髓间充质干细胞-长链非编码RNA

一种基于长链非编码RNA的鉴定骨髓间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒，包括用于测定LncRNACASC2、LncRNABX357664和LncRNALINC00520表达水平的qPCR引物；所述鉴定骨髓间充质干细胞传代次数指鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞。

所述测定LncRNACASC2、LncRNABX357664和LncRNALINC00520表达水平指测定LncRNACASC2、LncRNABX357664和LncRNALINC00520相对于内参U6的相对表达水平。

LncRNACASC2的qPCR上游引物为5'-CGACTGGTGAGCTTGCTGATGATTC-3'；

LncRNACASC2的qPCR下游引物为5'-AAGTGTTCCTGTTGCGCCTCTTGAT-3'。

LncRNABX357664的qPCR上游引物为5'-AGTCGTATAGCACTTGATAGAGAGGC-3'；

LncRNABX357664的qPCR下游引物为5'-CGCAGTTCTTCACCGTCGGTAGGAAA-3'。

LncRNALINC00520的qPCR上游引物为5'-ATGCTCAGGTATATAACGATGAGTCGC-3'；

LncRNALINC00520的qPCR下游引物为5'-CACACAAACATAGACGGGGACCATG-3'。

内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'；

内参U6的qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

骨髓间充质干细胞-微小RNA

一种基于微小RNA的鉴定骨髓间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒，包括用于测定hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325和hsa-miR-511-3p表达水平的qPCR引物；所述鉴定骨髓间充质干细胞传代次数指鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞。

优选地，所述测定hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325和hsa-miR-511-3p表达水平指测定hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325和hsa-miR-511-3p相对于内参U6的相对表达水平。

hsa-miR-378a-5p的qPCR上游引物为5'-CTACACTGACGTGTGTATCACAGAC-3'；

hsa-miR-378a-5p的qPCR下游引物为5'-ATGGTAGAAAACAGGCTACGACGG-3'。

hsa-miR-325的qPCR上游引物为5'-TGACGGATTGATGTTAGAGGGATG-3'；

hsa-miR-325的qPCR下游引物为5'-CGGAAAGCCCTAGCAGGATAATCT-3'。

hsa-miR-511-3p的qPCR上游引物为5'-GTTACTTAGGCCTGCGGTTGGAAG-3'；

hsa-miR-511-3p的qPCR下游引物为5'-GTCTAGTGGATCTTCGTCTGCGTC-3'。

内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'；

内参U6的qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

骨髓间充质干细胞-环状RNA

一种基于环状RNA的鉴定骨髓间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒，包括用于测定hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283和hsa_circ_0019223表达水平的qPCR引物；鉴定骨髓间充质干细胞传代次数指鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞。

优选地，测定hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283和hsa_circ_0019223表达水平指测定hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283和hsa_circ_0019223相对于内参U6的相对表达水平。

hsa_circ_0079888的qPCR上游引物为5'-CCCACGATTGTGAGACTACCAATGA-3'；

hsa_circ_0079888的qPCR下游引物为5'-ACTCTTATGCGGATAAGTAAAGCTTC-3'。

hsa_circ_0010283的qPCR上游引物为5'-CATACGTGGATCAGTTGACCCACGAT-3'；

hsa_circ_0010283的qPCR下游引物为5'-GACAGTGCCACTGTAGGACTACTTA-3'。

hsa_circ_0019223的qPCR上游引物为5'-AATCATATACAAGAGGCTTGCCGTG-3'；

hsa_circ_0019223的qPCR下游引物为5'-GTACTAGCGAATTGTCCGCAGAGCA-3'。

内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'；

内参U6的qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

脐带间充质干细胞-长链非编码RNA

一种基于长链非编码RNA的鉴定脐带间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒，包括用于测定LncRNALINC01140、LncRNAMALAT-1和LncRNALINC01116表达水平的qPCR引物；所述鉴定脐带间充质干细胞传代次数指鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞。

优选地，所述测定LncRNALINC01140、LncRNAMALAT-1和LncRNALINC01116表达水平指测定LncRNA LINC01140、LncRNAMALAT-1和LncRNA LINC01116相对于内参U6的相对表达水平。

LncRNALINC01140的qPCR上游引物为5'-ATTTGCTCTAGGGACACTCG-3'，qPCR下游引物为5'-TTCATCACCATTAGGTTGCG-3'。

LncRNAMALAT-1的qPCR上游引物为5'-CTTCCAGTATCGAGTGAGCA-3'，qPCR下游引物为5'-GCTAGCATAGTAGTAATCGA-3'。

LncRNALINC01116的qPCR上游引物为5'-ATGAGTACTACATGCGAGCTGC-3'，qPCR下游引物为5'-TGTGATACAGATAGACGCTACG-3'。

优选地，内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'，qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

脐带间充质干细胞-微小RNA

一种基于微小RNA的鉴定脐带间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒，包括用于测定hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-223-5p表达水平的qPCR引物；鉴定脐带间充质干细胞传代次数指鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞。

优选地，所述测定hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-223-5p表达水平指测定hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-223-5p相对于内参U6的相对表达水平。

hsa-miR-532-3p的qPCR上游引物为5'-TGTCCGCCATATGCATGATCCAA-3'，qPCR下游引物为5'-AGTACAACTAGAGGCATGGAATG-3'。

hsa-miR-146a-5p的qPCR上游引物为5'-TGATTCGCCGTACTGTTGTTTGTCT-3'，qPCR下游引物为5'-CGTTGTCGTGACAATGCTGTGAAC-3'。

hsa-miR-223-5p的qPCR上游引物为5'-AGACTTCCACTTAGAATGAACC-3'，qPCR下游引物为5'-TGCTGAGGGACGTAGCGTGCG-3'。

优选地，内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'，qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

脐带间充质干细胞-环状RNA

一种基于环状RNA的鉴定脐带间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒，包括用于测定hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389和hsa_circ_0077559表达水平的qPCR引物；所述鉴定脐带间充质干细胞传代次数指鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞。

优选地，测定hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389和hsa_circ_0077559表达水平指测定hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389和hsa_circ_0077559相对于内参U6的相对表达水平。

hsa_circ_0052766的qPCR上游引物为5'-ACTGAAGCACTTTAGACAGATA-3'，qPCR下游引物为5'-CTCAGACCCACGTTGGACATGA-3'。

hsa_circ_0019389的qPCR上游引物为5'-TGCCCTAGATTGAGTGACCATACAG-3'，qPCR下游引物为5'-GCAGCTTTCCTAACCATAAGACGTG-3'。

hsa_circ_0077559的qPCR上游引物为5'-TTACGATGGACTGAACGTGATA-3'，qPCR下游引物为5'-CATAACTCCTCGCTGATGACCA-3'。

优选地，内参U6的qPCR上游引物为5'-TTTAGGCTTGCCTCTGTAGTA-3'，qPCR下游引物为5'-GAACCCTGCCAGGTGATTTTG-3'。

优选地，还包括逆转录试剂和qPCR试剂等。

本发明提供的基因检测试剂盒具有如下优点：

第一，可以用于测定商品化骨髓间充质干细胞是属于增殖能力高、活力强的P1～P5代还是增殖能力较弱、活力较弱的P6～P10代；可以用于测定商品化人脐带间充质干细胞是属于增殖能力高、活力强的P1～P10代还是增殖能力较弱、活力较弱的P11～P20代；

第二，实验室自己冻存作为种子细胞的骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞常常因标签损坏而无法确定该骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞的代数，通过本发明试剂盒可以测定该人骨髓间充质干细胞属于P1～P5代还是P6～P10代，或测定该人脐带间充质干细胞属于P1～P10代还是P11～P20代；

第三，可以直接以冻存的间充质干细胞进行分析检测，无需解冻复苏，简单、高效。

附图说明

图1为LncRNACASC2、LncRNABX357664、LncRNALINC00520联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的ROC曲线；

图2为hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的ROC曲线；

图3为hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的ROC曲线；

图4为LncRNA LINC01140、LncRNA MALAT-1、LncRNA LINC01116联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的ROC曲线；

图5为hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的ROC曲线；

图6为hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。

实施例1：鉴定骨髓间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒

一、实验材料

L-DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司。RNA提取试剂盒TRIzol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，qPCR试剂购自Vazyme公司。

二、实验方法

1、骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及连续传代

无菌抽取健康志愿者的骨髓液5ml并肝素化，与等量体积、含10％胎牛血清的L-DMEM培养液混匀，置于ficoll分离液(比重1.077)上，2000r/min离心20min，离心后可见混合液从上至下共分四层：最上层淡黄色的为血清；第二层为菲薄的白膜层即单个核细胞；第三层为无色透明的淋巴细胞分离液；最底层为红细胞层。收集白膜层中的单个核细胞，以含10％胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞并进行计数，以1×10⁶/ml的密度接种于50ml的培养瓶中，置于37℃、体积分数5％的CO2培养箱孵育。24h后全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞，此后隔天进行半量换液，即为原代(P0)骨髓间充质干细胞。

待原代培养细胞贴培养瓶底面积达60％～70％左右时，吸尽培养基并用PBS洗涤1次，加入37℃预温的0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA各0.5ml混合消化细胞，约3min后镜下可见细胞收缩变短、间隙增大，加入含10％胎牛血清的L-DMEM终止消化。用吸管轻轻吹打直至贴壁细胞悬浮，吸取细胞悬液，1000r/min离心5min，洗涤2次。最后用10％胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，分别接种于两瓶50ml的培养瓶中，此时的细胞称为P1代细胞。同法进行以后各代细胞的传代培养直至传至P10代。将P1～P10代骨髓间充质干细胞分别分装于1.5ml细胞冻存管-80℃冻存，每代若干管，标号，备用。

2、总RNA提取和目标RNA相对表达水平测定

将冻存管从液氮中取出，按照冻存细胞直接提取RNA的方法用RNA提取试剂盒TRIzol提取总RNA，NanoDrop ND-1000测定260nm/280nm吸光度比值范围1.8～2.0。

以U6作为内参，根据逆转录试剂盒、qPCR试剂使用说明书采用qPCR法检测各样本中目标RNA的相对表达水平，结果采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。

目标RNA及内参U6的qPCR引物如下表所示。

3、数据分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均值±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以M(QR)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料比较采用Fisher's确切概率法。

采用二元Logistic回归分析计算LncRNA CASC2、LncRNA BX357664、LncRNA LINC00520联合的Logistic回归方程；绘制LncRNACASC2、LncRNABX357664、LncRNA LINC00520及其联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用二元Logistic回归分析计算hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p联合的Logistic回归方程；绘制hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p及其联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用二元Logistic回归分析计算hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223联合的Logistic回归方程；绘制hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223及其联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、LncRNACASC2、LncRNABX357664、LncRNALINC00520及其联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的价值

随机选取P1～P5代骨髓间充质干细胞每代各20管和P6～P10代骨髓间充质干细胞每代各20管作为训练集；另随机选取P1～P5代骨髓间充质干细胞每代各20管和P6～P10代骨髓间充质干细胞每代各20管作为验证集。

训练集中，LncRNA CASC2、LncRNABX357664、LncRNA LINC00520在P6～P10代骨髓间充质干细胞中的相对表达量比在P1～P5代骨髓间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3.5～4.5倍。LncRNA CASC2、LncRNA BX357664、LncRNA LINC00520鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC分别为0.713、0.742、0.735。以骨髓间充质干细胞代数为因变量(赋值：P1～P5代＝0，P6～P10＝1)，LncRNACASC2、LncRNA BX357664、LncRNA LINC00520为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-3.035+7.204×LncRNA CASC2+4.288×LncRNA BX357664+5.205×LncRNALINC00520，其鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC为0.961，截断值为4.382(ROC曲线见图1)。LncRNACASC2、LncRNABX357664、LncRNALINC00520联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC显著大于LncRNACASC2、LncRNABX357664、LncRNA LINC00520单独鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本LncRNACASC2、LncRNABX357664、LncRNALINC00520相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为P6～P10代骨髓间充质干细胞，低于截断值的预测为P1～P5代骨髓间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为96.5％。

2、hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p及其联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的价值

随机选取P1～P5代骨髓间充质干细胞每代各20管和P6～P10代骨髓间充质干细胞每代各20管作为训练集；另随机选取P1～P5代骨髓间充质干细胞每代各20管和P6～P10代骨髓间充质干细胞每代各20管作为验证集。

训练集中，hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p在P6～P10代骨髓间充质干细胞中的相对表达量比在P1～P5代骨髓间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3.5～4.5倍。hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC分别为0.702、0.709、0.748。以骨髓间充质干细胞代数为因变量(赋值：P1～P5代＝0，P6～P10＝1)，hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-3.747+6.021×hsa-miR-378a-5p+5.924×hsa-miR-325+4.699×hsa-miR-511-3p，其鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC为0.943，截断值为3.878(ROC曲线见图2)。hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC显著大于hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p单独鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为P6～P10代骨髓间充质干细胞，低于截断值的预测为P1～P5代骨髓间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为93.5％。

3、hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223及其联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的价值

随机选取P1～P5代骨髓间充质干细胞每代各20管和P6～P10代骨髓间充质干细胞每代各20管作为训练集；另随机选取P1～P5代骨髓间充质干细胞每代各20管和P6～P10代骨髓间充质干细胞每代各20管作为验证集。

训练集中，hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223在P6～P10代骨髓间充质干细胞中的相对表达量比在P1～P5代骨髓间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调4.0～5.0倍。hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC分别为0.752、0.749、0.757。以骨髓间充质干细胞代数为因变量(赋值：P1～P5代＝0，P6～P10＝1)，hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-4.117+5.930×hsa_circ_0079888+5.778×hsa_circ_0010283+5.949×hsa_circ_0019223，其鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC为0.977，截断值为4.005(ROC曲线见图3)。hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223联合鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC显著大于hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223单独鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为P6～P10代骨髓间充质干细胞，低于截断值的预测为P1～P5代骨髓间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为97.5％。

4、鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的试剂盒

一种鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的试剂盒，含有LncRNA CASC2、LncRNABX357664、LncRNA LINC00520、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。LncRNACASC2、LncRNABX357664、LncRNA LINC00520、内参U6的qPCR引物如下表所示。

一种鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的试剂盒，含有hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-325、hsa-miR-511-3p、内参U6的qPCR引物如下表所示。

一种鉴定区分P1～P5代骨髓间充质干细胞和P6～P10代骨髓间充质干细胞的试剂盒，含有hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。hsa_circ_0079888、hsa_circ_0010283、hsa_circ_0019223、内参U6的qPCR引物如下表所示。

实施例2：鉴定脐带间充质干细胞传代次数的基因检测试剂盒

一、实验材料

DMEM/F12培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司。RNA提取试剂盒TRIzol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，qPCR试剂购自Vazyme公司。

二、实验方法

1、脐带间充质干细胞的体外分离、培养及连续传代

①消化：取8cm左右脐带组织(来自健康足月剖宫产的新生儿)，用无菌PBS洗涤去除残血，剪成约1mm×1mm×1mm大小，经0.15％胶原酶Ⅱ，37℃温育消化4h，200目筛网过滤，收集细胞并用锥虫蓝染色计数活细胞数。②贴壁分离：将细胞悬浮于含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养液，接种到T25培养瓶中，控制接种细胞浓度为2.4×10⁴/cm²，置37℃、体积分数为5％CO2培养箱中，饱和湿度培养3d后全量换液，继续培养并观察细胞生长情况(此细胞即为原代脐带间充质干细胞P0)。③传代：当培养细胞达到90％融合时，用消化液(0.25％胰酶-0.01％EDTA溶液)处理约3min、离心、弃上清、沉淀细胞用完全培养液重悬并用锥虫蓝计数，接种于新的T25培养瓶中，控制接种细胞浓度为2.4×10⁴/cm²，置CO2培养箱中继续培养并观察细胞生长情况，此细胞即为P1代细胞。同法进行以后各代细胞的传代培养直至传至P20代。将P1～P20代脐带间充质干细胞分别分装于1.5ml细胞冻存管-80℃冻存，每代若干管，标号，备用。

2、总RNA提取和目标RNA相对定量测定

将冻存管从液氮中取出，按照冻存细胞直接提取RNA的方法用RNA提取试剂盒TRIzol提取总RNA，NanoDrop ND-1000测定260nm/280nm吸光度比值范围1.8～2.0。

以U6作为内参，根据逆转录试剂盒、qPCR试剂使用说明书采用qPCR法检测各样本中目标RNA的相对表达水平，结果采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。

目标RNA及内参U6的qPCR引物如下表所示。

3、数据分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均值±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以M(QR)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料比较采用Fisher's确切概率法。

采用二元Logistic回归分析计算LncRNA LINC01140、LncRNA MALAT-1、LncRNA LINC01116联合的Logistic回归方程；绘制LncRNALINC01140、LncRNAMALAT-1、LncRNA LINC01116及其联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用二元Logistic回归分析计算hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p联合的Logistic回归方程；绘制hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p及其联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

采用二元Logistic回归分析计算hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559联合的Logistic回归方程；绘制hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559及其联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算ROC曲线下面积(AUC)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、LncRNA LINC01140、LncRNA MALAT-1、LncRNA LINC01116及其联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的价值

随机选取P1～P10代脐带间充质干细胞每代各20管和P11～P20代脐带间充质干细胞每代各20管作为训练集；另随机选取P1～P10代脐带间充质干细胞每代各20管和P11～P20代脐带间充质干细胞每代各20管作为验证集。

训练集中，LncRNA LINC01140、LncRNA MALAT-1、LncRNA LINC01116在P11～P20代脐带间充质干细胞中的相对表达量比在P1～P10代脐带间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调2～3倍。LncRNA LINC01140、LncRNA MALAT-1、LncRNA LINC01116鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC分别为0.655、0.636、0.671。以脐带间充质干细胞代数为因变量(赋值：P1～P10代＝0，P11～P20＝1)，LncRNA LINC01140、LncRNAMALAT-1、LncRNA LINC01116为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-2.104+4.413×LncRNALINC01140+3.790×LncRNA MALAT-1+4.035×LncRNALINC01116，其鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC为0.915，截断值为2.771(ROC曲线见图4)。LncRNA LINC01140、LncRNA MALAT-1、LncRNA LINC01116联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC显著大于LncRNA LINC01140、LncRNA MALAT-1、LncRNALINC01116单独鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本LncRNALINC01140、LncRNAMALAT-1、LncRNALINC01116相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为P11～P20代脐带间充质干细胞，低于截断值的预测为P1～P10代脐带间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为92.75％。

2、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p及其联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的价值

随机选取P1～P10代脐带间充质干细胞每代各20管和P11～P20代脐带间充质干细胞每代各20管作为训练集；另随机选取P1～P10代脐带间充质干细胞每代各20管和P11～P20代脐带间充质干细胞每代各20管作为验证集。

训练集中，hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p在P11～P20代脐带间充质干细胞中的相对表达量比在P1～P10代脐带间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调2.5～3.5倍。hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC分别为0.665、0.684、0.679。以脐带间充质干细胞代数为因变量(赋值：P1～P10代＝0，P11～P20＝1)，hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-3.023+3.885×hsa-miR-532-3p+5.025×hsa-miR-146a-5p+4.157×hsa-miR-223-5p，其鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC为0.925，截断值为2.998(ROC曲线见图5)。hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC显著大于hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p单独鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为P11～P20代脐带间充质干细胞，低于截断值的预测为P1～P10代脐带间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为93.25％。

3、hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559及其联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的价值

随机选取P1～P10代脐带间充质干细胞每代各20管和P11～P20代脐带间充质干细胞每代各20管作为训练集；另随机选取P1～P10代脐带间充质干细胞每代各20管和P11～P20代脐带间充质干细胞每代各20管作为验证集。

训练集中，hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559在P11～P20代脐带间充质干细胞中的相对表达量比在P1～P10代脐带间充质干细胞中的相对表达量分别显著上调3.0～4.0倍。hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC分别为0.705、0.724、0.717。以脐带间充质干细胞代数为因变量(赋值：P1～P10代＝0，P11～P20＝1)，hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559为自变量(连续型变量)，进行二元Logistic回归分析，结果显示，Logit(P)＝-0.395+5.003×hsa_circ_0052766+4.751×hsa_circ_0019389+4.805×hsa_circ_0077559，其鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC为0.939，截断值为3.682(ROC曲线见图6)。hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559联合鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC显著大于hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559单独鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的AUC。

验证集中，分别将各样本hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559相对表达水平代入二元Logistic回归方程，高于截断值的预测为P11～P20代脐带间充质干细胞，低于截断值的预测为P1～P10代脐带间充质干细胞，并与实际代数比较，结果该方法预测准确率为94.00％。

4、鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的试剂盒

一种鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的试剂盒，含有LncRNA LINC01140、LncRNAMALAT-1、LncRNALINC01116、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。LncRNA LINC01140、LncRNA MALAT-1、LncRNA LINC01116、内参U6的qPCR引物如下表所示。

一种鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的试剂盒，含有hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。hsa-miR-532-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-223-5p、内参U6的qPCR引物如下表所示。

一种鉴定区分P1～P10代脐带间充质干细胞和P11～P20代脐带间充质干细胞的试剂盒，含有hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559、内参U6的qPCR引物，还含有逆转录试剂、qPCR试剂。hsa_circ_0052766、hsa_circ_0019389、hsa_circ_0077559、内参U6的qPCR引物如下表所示。

上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。