DNA合成测序方法与测序系统与流程

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种DNA合成测序方法与测序系统。

背景技术：

人类基因组测序计划的完成，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具有重要意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是第二代DNA测序技术之一。合成法测序通过把大量待测模板DNA片段固定，并在固定的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，然后四种碱基荧光标记核苷酸依次在DNA引物上延伸、断裂，通过荧光倒置显微镜检测荧光素，实现高通量并行的DNA序列测定。

在合成法测序中，通过可裂解连接单元(Cleavable Linker)将荧光素与核苷酸连接起来形成的可逆终止剂(Reversible Terminator)，其电子效应与空间位阻在参与DNA延伸、断裂可裂解连接单元以便除去荧光素等过程中发挥着极为重要的作用，直接影响甚至决定测序的效率、读长等关键技术指标。为了确保参与DNA延伸时，当模板为连续多个相同碱基时，一次只延伸一个可逆终止剂，目前在Illumina公司广泛使用的可逆终止剂为3′-羟基阻断的修饰核苷酸。这样在测序过程中需要将标记的荧光素与3′-羟基保护基同时完全去掉，这样对测序试剂的结构设计、合成以及测序过程均提出了很高的要求。

首先3'-OH保护的修饰核苷酸合成复杂；其次在实际测序过程中，使用3'-OH保护的可逆终止剂进行延伸之后需要将两个反应位点同时断裂，即连接单元100％断裂的同时也需要以100％效率将3'-OH去保护。但是这两个位点往往不能在相同条件下同时完全断裂，这势必导致错误信息不断累积，最终影响测序的读长和效率。而DNA测序需要100％去除，最后3'-OH保护的修饰核苷酸参与DNA链延伸时，面临的另一个巨大挑战为DNA聚合酶不易识别、延伸反应慢且容易错配(Ref:Michael L.Metzker,Nucleic Acids Research2012,40,7404；Michael L.Metzker；Nature Reviews Genetics 2010,11,31.)。

基于二硫键连接单元的可逆终止剂在二代测序与单分子测序中均已得到应用，然而文献(Nucleic Acids Research,2008,36,No.4e25)报道基于二硫键的可逆终止剂为单色荧光标记四个不同碱基的核苷酸，Helicos公司为了确保二硫键可逆终止剂作为单分子测序试剂一次只延伸一个可逆终止剂，在荧光素旁边又连接了一个位阻很大的核苷一磷酸或者二膦酸，空间位阻如此大的可逆终止剂的确能够做到一次只延伸一个，然而其合成路线极为繁杂，过大的位阻同时也造成参与DNA链延伸时酶不好识别且速度慢、错配率高(Michael L.Metzker；Nature Reviews Genetics 2010,11,31.)。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述缺点，本发明提供了一种DNA合成测序方法与测序系统。通过水溶性双功能连接单元将引物固定于玻璃表面，然后将待测DNA信息通过等温扩增表面放大原理复制于玻片表面，最后在DNA聚合酶作用下，将合成的四色荧光标记核苷酸在玻片表面延伸、成像、断裂并再次延伸，重复此循环，从而完成多次测序循环。本发明提供的测序系统与方法适用于任何DNA片段的测序。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明通过水溶性双功能连接单元将引物连接于基体表面，该双功能连接单元的一端通过酰胺键与基体上的氨基反应从而连接在基体表面，另一端通过点击化学反应与引物相连，将两端分别修饰了与引物P1序列互补但与Pe序列相同的待测DNA模板在基体表面通过等温扩增原理将大量待测DNA模板信息复制于流通池反应器。

然后用TE缓冲液将上述经过等温扩增表面放大的流通池反应器洗涤，并加入引物Pe与固定在基体表面的待测DNA簇杂交，在DNA聚合酶作用下，加入延伸反应混合液，合成的四色荧光可逆终止剂即可参与DNA链延伸，形成含荧光的模板/引物核酸复合物。对延伸后的模板/引物核酸复合物进行荧光成像，以确定参与延伸的DNA碱基种类。加入相应的断裂用化学试剂(酸敏感连接单元需要加入酸性溶液，偶氮连接单元需要加入连二亚硫酸钠，二硫键需要加入DTT),使参与延伸的可逆终止剂上的连接单元断裂，对于二硫键断裂后还需要加入碘乙酰胺将新生成的巯基保护起来。

重复上述延伸和断裂步骤，即获得待测模板核苷酸的碱基序列。

具体来说，包括以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种DNA合成测序方法，包括以下步骤：

A、通过水溶性双功能连接单元将引物P1连接于基体表面；

B、在基体表面加入含待测DNA模板的溶液，然后加入表面放大反应液进行表面放大反应；

C、经步骤B处理后，将引物Pe加入基体表面，然后在基体表面加入含预定浓度的四种不同荧光素标记四种不同碱基的可逆终止剂的延伸反应溶液，进行延伸反应；然后对延伸后的DNA双链进行荧光成像；

D、成像之后，加入相应的断裂用化学试剂，使参与延伸后连接在DNA链上的四色荧光可逆终止剂中含有的链接单元断裂；

E、重复步骤C和D，完成多次循环测序，即可获得待测DNA模板核苷酸的碱基序列。

优选地，步骤D中，所述断裂用化学试剂选自酸性溶液、连二亚硫酸钠或DTT。对于酸敏感，需要加入酸性溶液；对于偶氮连接单元，需要加入连二亚硫酸钠；对于二硫键，需要加入DTT。且对于二硫键断裂后，还需要将新生成的巯基用碘乙酰胺保护。

优选地，所述四种不同荧光素标记不同碱基的可逆终止剂中，采用的可裂解连接单元选自：酸敏感或二硫键SS或偶氮键

所用的荧光素选自：

形成的可逆终止剂为以下结构中的任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止剂：dUTP可逆终止剂XIV,XIII,VI或XVII、dATP可逆终止剂XI,IX,XV或XIX、dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI或XX、dGTP可逆终止剂VIII,X,XVIII或XXI，具体结构如下所示：

我们设计合成了系列3′-OH未保护荧光标记核苷酸，该类修饰核苷酸作为测序用试剂，面临的最大挑战为当模板为连续多个相同碱基时，一次是否只能延伸一个可逆终止剂。我们的实验结果表明，我们发展的可逆终止剂具有延伸反应快、DNA聚合酶识别选择性高，不易发生错配且一次延伸反应只延伸一个可逆终止剂。

本发明所述的可逆终止剂在文献基础上进行结构调整和优化，能够做到在DNA聚合酶作用下，当模板为连续多个相同碱基时一次只延伸一个可逆终止剂，并且可实现100％断裂，反应干净、彻底，完美解决了3′-OH未保护核苷酸用于DNA测序时可能遇到的最大问题。

可逆终止剂已经引起广泛重视，然而不论是在二代合成测序还是三代单分子测序中，均很难做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，而我们经过结构调整以及DNA聚合酶的优化组合，做到了一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，这一点对于DNA测序是非常重要的发现。

在上述步骤A之前，还包括对基体表面进行活化和修饰的步骤；

所述活化步骤具体为：将干净的基体置于双氧水和浓硫酸的混合液中，在80-90℃下加热1h，使基体表面羟基化；

所述的修饰步骤具体为：将经活化步骤后的基体在溶剂中与氨丙基三乙氧基硅烷在60℃下加热反应2小时，得到表面带有氨基的基体。

优选地，步骤A中，所述水溶性双功能连接单元与基体连接的一端的反应活性官能团为羧基活性酯，与引物P1连接的一端的反应活性官能团为炔基或叠氮基。

优选地，步骤A中，所述水溶性双功能连接单元包括以下结构式中的至少一种：

优选地，步骤A具体包括以下步骤：

A1、将基体置于含有水溶性双功能连接单元的溶液中，室温下浸泡5h，超声后真空干燥；

A2、将引物1加入经步骤A1处理后的基体表面，室温下进行点击化学反应9h，即可；

所述引物P1为5’-N3或5’-炔基修饰的引物。

优选地，所述引物P1和引物Pe的碱基序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

优选地，步骤B中，所述在基体表面加入含待测DNA模板的溶液后，升温至50～70℃，保持5min；所述待测DNA模板为两端分别修饰了与引物P1序列互补，但与引物Pe序列相同的碱基序列。

优选地，步骤B中，所述表面放大反应的反应温度为50～70℃，反应时间为30～60min。

优选地，所述表面放大反应的反应温度为60℃，反应时间为45min。

优选地，步骤C中，所述延伸反应溶液中包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶为9°N,klenow或Therminator。

优选地，所述基体为玻璃或高分子材料基体。

本发明通过等温扩增表面放大获得基体表面连接了大量待测DNA簇,然后通过延伸、成像、除去标记的荧光素等步骤重复多次获得待测DNA的碱基序列。

第二方面，本发明提供了一种DNA合成测序系统，包括流通池反应器，流路系统，控制系统，检测系统和图像数据处理系统；

所述流通池反应器，流通池反应器包括采用水溶性双功能连接单元连接了引物P1的基体；所述基体材料可以是玻璃、高分子材料等，用于固定多条DNA链并形成一个适合合成测序用的反应容器；

流路系统，用于可控地操控各种试剂在流通池腔室内的进出；

所述控制系统包括温度控制系统和pH控制系统；温度控制系统，用于调节和维持流通池腔室内的温度；

pH值控制系统，用于调节测序过程中体系的酸碱度；

光学系统，包括激光光源，所述光学系统用于激发荧光；

检测器系统，用于检测和记录荧光信号；

图像数据处理系统，用于对延伸反应前后的荧光图像进行比对、分析及总结。

所述测序系统为自动化装置并由计算机控制。该系统所述的流通池反应器，通过温度控制系统可在精确的温度等反应条件下固定大量引物DAN序列，并通过等温扩增表面放大原理将待测DNA模板信息复制其中；然后通过流路系统将延伸反应体系各组份加入流通池反应器，从而进行多次的DNA链延伸、断裂等测序循环，流通池的温度等性能通过设置在计算机内的控制系统可以精确控制，当DNA链延伸之后通过CCD光学系统检测参与延伸的具体碱基，确定碱基之后除去荧光素，然后进行下一次延伸，完成多次测序循环。通过光学系统得到的数据采用计算机中的图像数据处理系统进行处理，最终得到待测DNA链的序列信息。

总之，DNA测序系统主要由三部分组成:

(1)等温扩增平台，用于在既定的玻片表面制备固定的DNA单分子克隆。注射按要求准备的浓度合适的文库于玻片表面，等温扩增过程即可根据设定的参数自动完成。为了确保该关键步骤的成功实施，使用者不可随意改变仪器预先设定的参数，公司会为此提供制备好的玻片和相关试剂。这样整个扩增过程按照标准化流程进行以确保结果准确无误。此外，要求使用者严格按照公司制定的流程操作。扩增之后的玻片可目测检查其是否合格，然后可提供给经验丰富的用户使用，或者提供给那些希望使用自己制备的玻片进行测序的用户，还可用于测序之外的其它用途。

(2)自动化数据读取系统，该系统用于准确读取DNA链的循环延伸信息。在相应的仪器中配置了一个单增强型CMOS传感器并配合自动化滤光轮以覆盖四色光的波长范围，从而可检测四种不同荧光素标记的核苷酸。通过程序化的流路控制系统来控制多次循环测序反应中每一步所需的溶液交换。所需的所有试剂都预先封装于特定的试剂盒中，使用者只需要将这些试剂盒塞进仪器相关部位即可。因为光学传感器尺寸小，所以需要一个由光学解码器控制的移动平台，可实现整个样品区域的扫描，以得到足够的数据量从而达到设计的通量。此外还需要一个性能稳定可靠的多波长LED光源用于照明。

(3)计算机工作站(包括控制系统和图像数据处理系统)，用于原始数据的质量评价和每个单分子克隆的碱基序列读取。该系统包括所有的控制程序、数据获取软件、图像和数据分析等软件，以及其它预先安装的软件包。

第三方面，本发明提供了一种DNA合成测序试剂盒，包括玻片、引物、水溶性双功能连接单元、扩增反应试剂、延伸反应试剂、去除标记荧光素的试剂和酶。

与现有技术比较，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的双功能连接单元水溶性良好，可以与反应体系各组分相互溶解，形成一个均相体系，有利于提高可逆终止剂延伸、可裂解连接单元的断裂等关键步骤的效率；同时该连接单元为双功能连接单元，其一端的羧基活性酯与玻璃表面的氨基生成酰胺键而连接于玻璃表面，另一端的炔基或者叠氮基只能与引物P1的叠氮基或者炔基发生点击化学反应而连接，从而避免了用两端相同的连接单元(比如两端均为羧基活性酯)时，部分连接单元的两端均可能与玻璃表面连接的问题。

2、本发明提供了一种DNA测序试剂，该类试剂为3′-OH未阻断的修饰核苷酸，即可逆终止剂(reversible terminators)，其共同特点为连接单元与荧光素共同构成一个大小合适的空间位阻，从而有效地保证了在实际测序循环中当模板存在连续多个相同碱基时一次只延伸一个可逆终止剂，解决了在合成测序中为了确保一次只延伸一个可逆终止剂的关键问题。到目前为止，3′-OH未阻断的可逆终止剂很难做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，而我们通过结构调整与优化，实现了精确的一次只延伸一个可逆终止剂的效果。相比之下目前二代测序，即合成测序广泛使用的是3′-OH阻断的可逆终止剂。

3、运用等温扩增表面放大原理将待测DNA信息复制于玻璃表面，在此过程中反应温度保持恒定，避免了连接在玻璃表面的DNA引物由于温度频繁变化而可能脱落。并且等温扩增表面放大方法很容易得到高密度DNA簇的流通池反应器,初步实验结果表明，我们得到的DNA簇密度已经大于Illumina在售商品的相关指标。

附图说明:

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明将引物固定于玻片的过程示意图；

图2为本发明等温表面放大原理示意图；

图3为本发明DNA合成测序方法示意图；

图4为23次延伸-断裂循环过程中第1,5,10,次循环的延伸(左)和断裂(右)荧光照片；

图5为23次延伸-断裂循环过程中第15,20,次循环的延伸(左)和断裂(右)荧光照片；

图6为四种波长通道的荧光背景信号；其中，图6a采用的波长通道为Cy3；图6b采用的波长通道为Cy3.5；图6c采用的波长通道为Cy5；图6d采用的波长通道为FITC；

图7为采用T3模板的荧光信号变化图；其中，图7a为用dATP可逆终止剂延伸的荧光信号；图7b为用断裂试剂处理后的荧光信号；图7c为不用断裂试剂处理，仅用荧光淬灭试剂处理再加dATP可逆终止剂观察到的荧光信号；

图8为四种不同模板(T1、T2、T3、T4)条件下DNA链多次延伸-断裂的荧光图；

图9为四种不同模板(T1、T2、T3、T4)23次循环的延伸/断裂的荧光强度变化数据；其中，图9a为T1模板；图9b为T2模板；图9c为T3模板；图9d为T4模板；

图10为四种不同模板(T1、T2、T3、T4)多次测序循环的主次信号比值；

图11为四色荧光可逆终止剂在等温扩增后不同密度DNA簇玻璃表面的DNA延伸结果；其中，图11a为高密度DNA簇条件下延伸后的荧光图；图11b为较低密度DNA簇条件下延伸后的荧光图；

图12为本发明的DNA合成测序系统示意图；

图13为实施例3中dUTP可逆终止剂的延伸结果；

图14为实施例3中dCTP可逆终止剂、dATP可逆终止剂和dGTP可逆终止剂的延伸结果；

图15为实施例3中dCTP可逆终止剂的多次延伸-断裂结果；其中，图15a为1-4次延伸-断裂结果；图15b为第4-6次延伸-断裂结果；

图16为实施例3中四种可逆终止剂同时延伸-断裂结果。

具体实施方式:

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：水溶性双功能连接单元的合成：

连接单元1如式I所示，直接购买。

连接单元2如式Ⅱ所示，

其合成路线如下：

具体合成步骤为：

1.Dicyclohexylcarbodiimide(DCC)(80mg；0.4mmol)和N,N-dimethylaminopyridine(3mg)加入到溶有三溴丙酸(化合物1)(43mg,0.28mmol)的乙酸乙酯(3mL)溶液中，在20℃的氩气保护的环境下搅拌5min,然后加入N-hydroxysuccinimide(化合物2)(72mg；0.6mmol)继续搅拌1h，反应液过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，用硅胶柱纯化，得到产物(化合物3)3-溴-2、5–氧代-1-吡咯烷基酯；

2.二溴乙醇(化合物4)(187.5mg,1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min。逐滴加入化合物3(118mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到化合物5；

3.二溴乙醇(化合物4)(187.5mg,1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min。逐滴加入化合物5(140mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到化合物6；

4.丙炔胺(化合物7)(55mg，1mmol)和化合物6(174mg,0.5mmol)加入15mL的乙腈中，50度反应20小时。冷却至室温，7500rpm离心5分钟。沉淀用乙腈和水洗涤3次，离心得到连接单元2。

连接单元3如式Ⅲ所示，

其合成路线如下：

具体步骤为：

1.DCC(80mg；0.4mmol)和N,N-dimethylaminopyridine(3mg)加入到溶有三溴丙酸(化合物1)(43mg,0.28mmol)的乙酸乙酯(3mL)溶液中，在20℃的氩气保护的环境下搅拌5min,然后加入N-hydroxysuccinimide(化合物2)(72mg；0.6mmol)继续搅拌1h，反应液过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，用硅胶柱纯化，得到产物(化合物3)3-溴-2、5–氧代-1-吡咯烷基酯；

2.二溴乙醇(化合物4)(187.5mg,1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物3(118mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到化合物5；

3.丙炔胺(化合物7)(55mg，1mmol)和化合物5(140mg,0.5mmol)加入15mL的乙腈中，50度反应20小时。冷却至室温，7500rpm离心5分钟。沉淀用乙腈和水洗涤3次，离心得到连接单元3。

连接单元4如式Ⅳ所示，

其合成路线如下：

具体合成步骤为：

1.叠氮化钠(1.3g，20mmol)和化合物4(3.1g，25mmol)加到50mL丙酮和水(1:1)的混合试剂中，加热回流4h.乙醚萃取两次，食盐水洗涤，干燥，减压蒸馏，得到化合物10.

2.DCC(80mg；0.4mmol)和N,N-dimethylaminopyridine(3mg)加入到溶有三溴丙酸(化合物1)(43mg,0.28mmol)的乙酸乙酯(3mL)溶液中，在20度的氩气保护的环境下搅拌5min,然后加入N-hydroxysuccinimide(化合物2)(72mg；0.6mmol)继续搅拌1h，反应液过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，用硅胶柱纯化，得到产物(化合物3)3-溴-2、5–氧代-1-吡咯烷基酯.

3.二溴乙醇(化合物4)(187.5mg,1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物3(118mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到化合物5.

4.化合物10(87mg，1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物5(140mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到连接单元4。

连接单元5如式Ⅴ所示，

其合成路线如下：

具体合成步骤为：

1.叠氮化钠(1.3g，20mmol)和化合物4(3.1g，25mmol)加到50mL丙酮和水(1:1)的混合试剂中，加热回流4h.乙醚萃取两次，食盐水洗涤，干燥，减压蒸馏，得到化合物10；

2.DCC(80mg；0.4mmol)和N,N-dimethylaminopyridine(3mg)加入到溶有三溴丙酸(化合物1)(43mg,0.28mmol)的乙酸乙酯(3mL)溶液中，在20度的氩气保护的环境下搅拌5min,然后加入N-hydroxysuccinimide(化合物2)(72mg；0.6mmol)继续搅拌1h，反应液过滤，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，用硅胶柱纯化，得到产物(化合物3)3-溴-2、5–氧代-1-吡咯烷基酯；

3.化合物10(87mg，1mmol)和KOH(33mg,0.6mg)加入25mL的DMSO溶剂冰浴氩气保护反应30min.逐滴加入化合物3(118mg，0.5mmol)继续反应4h。反应完成后用水淬灭，二氯甲烷萃取，NH4Cl(aq)，NaHCO3(aq)，NaCl(aq)洗涤，氯化钙干燥，有机相浓缩过柱，得到连接单元5。

实施例2：连接单元与可逆终止剂的合成

连接单元的合成路线如下：

具体合成步骤如下所示：

1)称取乙二醇(6.7ml，120mmol)和乙酸(2.4g，40mmol)于100mL单口瓶中搅拌，滴加0.112mL浓硫酸于反应液中，在25℃下搅拌24h。然后加入17mL饱和碳酸氢钠溶液搅拌过夜，再向反应混合液中加入12mL水，用二氯甲烷(50mL*8)萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂，残余物使用30:1CH2Cl2/MeOH为淋洗剂进行柱层析，得化合物1(2.52g)，产率61％。¹H NMR(400MHz,CDCl3):δppm4.20(t,2H,J＝4.8Hz),3.82(t,2H,J＝4.8Hz),2.09(s,3H),1.93(s,1H).

2)称取2-溴乙醇(9.96g,80mmol)和叠氮化钠(5.72g,88mmol)于100mL的双口瓶中，随后分别加入12mL的水和12mL的丙酮，在回流条件下搅拌6h。然后加入适量的氯化钠使反应液过饱和，滤去氯化钠固体，再用乙醚萃取滤液两次(50mL*2)，收集有机相，旋去溶剂得到淡黄色油状粗品2(8.92g)。¹H-NMR(400MHz,CDCl3):2.82(s,1H),3.45(t,2H,),3.75(t,2H).

3)将化合物1(4.16g,40mmol)和粗品化合物2(5.22g，60mmol)置于250mL双口瓶中，加入80mL无水THF溶解，然后加入PPTS(1.005g，4mmol)搅拌15min，再加入30g分子筛搅拌15min，最后加入呋喃醛(40mmol)，在室温下搅拌48h。停止反应，加入碳酸钾粉末使反应液呈中性，滤去固体，滤液浓缩后，以3:1PE/EtOAc为淋洗剂进行柱层析分离，得预期化合物，产率21％。

4)取上述产物(2.76mmol)置于100mL单口瓶中，加入20mL甲醇溶解，然后加入碳酸钾(8.28mmol)及1mL水，25℃下搅拌过夜。向反应液加入适量的水，用二氯甲烷萃取，干燥后后再旋干溶剂，得到预期产物，产率80％。

5)将化合物4(0.243mmol)溶于3mL甲醇中，再加入5mg Pd/C(10％)，抽真空换气，然后充入氢气于25℃下搅拌过夜。反应混合液过滤，滤液旋干溶剂后得预期连接单元，产率67％。¹H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.41(s,1H),6.43(s,1H),6.36(s,1H),5.60(s,1H),3.73(m,2H),3.60-3.57(m,4H),2.89(m,2H).

相应地，合成了四个基于呋喃缩醛的酸敏感可逆终止剂，其结构如下所示。其合成方法参考专利201410186697.6。

其他用于本发明的可逆终止剂采用常规方法合成即可。

实施例3：等温扩增表面放大

(1)玻片表面活化使之羟基化

将玻片(4×4mm)分别用乙醇和水洗涤三次,吹干,置于双氧水(H2O2，30％)和浓硫酸(H2SO4，98％)的混合液(V(H2O2):V(H2SO4)＝7:3)中,在80-90℃下加热1h,取出,用大量水冲洗,吹干。

(2)玻片表面修饰

将上述处理过的玻片置于无水乙醇中；加入氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)使体系中APTES与无水乙醇的质量比为1:49，升温至60℃，加热2h，然后冷却至室温；APTES通过硅氧硅键连接在玻璃表面，然后分别用乙醇、纯水冲洗，得到表面带有氨基的玻片；将表面带有氨基的玻片浸入二甲基甲酰胺(DMF)与三乙胺(Et3N)的混合液中，[DMF/Et3N,9:1(v/v)]，浸泡1h后超声5min，然后分别用DMF和乙醇清洗一遍，室温干燥。

(3)玻片表面连接水溶性双功能连接单元

将上述清洗并干燥的玻片置于含实施例1制得的各水溶性双功能连接单元(Linker)的溶液中{20mM Linker in[DMF/pyridine,9:1(v/v)]}，室温浸泡5h，超声5min，真空干燥。水溶性双功能连接单元中的活性酯与玻璃表面的氨基反应，Linker通过酰胺键连接在玻璃表面。由此可获得连接不同水溶性双功能连接单元的玻片表面。本发明使用的水溶性双功能连接单元2-5均为自行合成，它们均具有良好的水溶性，在测序体系中可以很好地与测序体系中的其他物质相溶，为均相体系，有利于提高反应效率。

(3)5′-N3修饰的引物(P1)固定于玻片上

将5′-N3修饰的primer引物(P1)溶于DMSO/H2O[1:2(vol/vol)]中，配成30μM的溶液；取该引物溶液10μL滴加于玻片表面，分别滴加1nmol碘化亚铜(CuI)和1nmol二异丙基乙胺(DIPEA)，在室温下反应9h；通过click反应将5’-N3修饰的primer连接在玻璃表面。将连接了primer的玻片用去离子水洗涤，再用SPSC buffer(0.25M磷酸钠/2.5M氯化钠，pH 6.5)浸泡1h，室温晾干。

以水溶性双功能连接单元的一端为炔基，引物为5′-叠氮修饰P1为例说明(如图1所示)；当水溶性双功能连接单元为式IV和式V所示结构时，水溶性双功能连接单元的一端为叠氮，而相应的引物为5′-炔基修饰的P1，同样以点击化学反应将引物连接于玻璃表面。

(4)表面放大扩增反应

将模板T(T1，T2，T3，T4)分别用TE缓冲液(10mM Tris-HCland 1mM EDTA pH＝8.0)溶解配成30μM溶液；

取配成的含T1，T2，T3，T4的溶液各0.25μL混合均匀后，滴加到固定了primer引物(P1)的玻片表面，升温至65℃，保持5min，自然冷却到室温；

配制表面放大反应液,以反应液总体积25μL计，其中包括以下组分及含量:

Bst Polymerase:1μL(8U)；10×ThermoPol buffer:2.5μL；

MgSO4(100mM):1.5μL；Pe(30μM):10μL；

dNTPs mix(2.5mM each):10μL。

将制备的表面放大反应液滴加到玻片上，于60℃下保持45min进行表面放大反应，其原理如图2所示，结束后用TE缓冲液冲洗。

P1(SEQ ID No.1)：5′N3-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Pe(SEQ ID No.2)：5′-CAACAACAACAACAACAACAACAACAA

T1(SEQ ID No.3)：

5′-CAACAACAACAACAACAACAACAACAATTACTACGAAGCTACATCAAGTTAGTAGTTTTCGAACGTAGCTACGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

T2(SEQ ID No.4)：

5′-CAACAACAACAACAACAACAACAACAAGCCTGTACCTAAAGTTGGCCAGACACCGCATTCGAACGTAGCTACGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

T3(SEQ ID No.5)：

5′-CAACAACAACAACAACAACAACAACAAAGTGACGATCTGCCGGATTGCCGTTGGTACTTCGAACGTAGCTACGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

T4(SEQ ID No.6)：

5′-CAACAACAACAACAACAACAACAACAACAGACGTTGGCTGTACCAGTTACGCATCGGTTCGAACGTAGCTACGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

本实施例中采用的引物固定及等温扩增表面放大技术的优势如下:

1.连接单元为水溶性双功能连接单元，首先连接单元的活性酯一端与基底表面的氨基反应，以酰胺键连接于玻璃表面，而另一端通过点击化学反应与5′-N3或者炔基修饰的引物相连，避免了两端为相同反应官能团时，部分连接单元的两端均可与玻璃表面相连；另外当连接单元固定于玻璃表面时，良好的水溶性使之能够与体系各组分相溶，有利于提高后续的表面放大及测序反应效率。

2.表面放大的温度不变固定在60℃，不会由于温度频繁变动而导致固定于玻片表面的DNA分子的脱落以致影响后续的测序过程。

3.在30-60min内就可以产生数以千万计的DNA簇，放大效率高，可满足高通量测序要求。

4.操作简单，重复性好，成本低。

实施例4：用测序胶验证本发明的可逆终止剂完全可以做到一次只延伸一个可逆终止剂

我们设计合成的可逆终止剂采用四色荧光标记四个不同碱基核苷酸，相比单色可逆终止剂，具有显而易见的测序快、在延伸体系中同时加入四种可逆终止剂可有效减少错配、增大碱基之间相互准确识别等优势。我们的可逆终止剂结构简单、合成容易且较延伸位阻小，更为重要的是当模板为连续多个碱基时，一次只延伸一个可逆终止剂，延伸效率几乎为100％，用断裂试剂将连接单元断裂后可再次延伸，并且断裂与再次延伸的效率均为100％。

在本实施例中，我们用合成的dUTP可逆终止剂为例(具体结构式为化合物XIV,XIII,VI或XVII)，用测序胶验证其延伸结果，发现当模板为连续多个相同碱基时，可逆终止剂XIV,XIII,VI或XVII一次均只延伸一个，且延伸效率均为100％。如图13所示，各泳道说明如下：

Lane 1:24nt；

Lane 2:25nt；

Lane 3:oligo 2-3,XIV,XIII,VI或XVII,延伸产物；(模板一个A)

Lane 4：oligo 2-4,XIV,XIII,VI或XVII,延伸产物；(模板2个A)

Lane 5：oligo 2-5,XIV,XIII,VI或XVII,延伸产物；(模板4个A)。

在此基础上，我们进一步合成了采用不同荧光素标记的其它三个碱基的可逆终止剂：dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI或XX；dATP可逆终止剂XI,IX,XV或XIX和dGTP可逆终止剂VIII,X,XVIII或XXI。用测序胶验证其延伸结果，如图14所示，各泳道如下：

Lane 1:24nt；

Lane 2:25nt；

Lane 3:XII,VII,XVI或XX,延伸产物；(模板一个G)

Lane 4：XII,VII,XVI或XX,延伸产物；(模板二个G)

Lane 5：XI,IX,XV或XIX,延伸产物；(模板一个T)

Lane 6:XI,IX,XV或XIX,延伸产物；(模板二个T)

Lane 7：VIII,X,XVIII或XXI,延伸产物；(模板一个C)

Lane 8：VIII,X,XVIII或XXI,延伸产物；(模板三个C)

模板序列如下：

3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCGTCGA(SEQ ID No.8)

3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCGGCGA(SEQ ID No.9)

3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCTACGA(SEQ ID No.10)

3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCTTCGA(SEQ ID No.11)

3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCCTCGA(SEQ ID No.12)

3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCCCCGA(SEQ ID No.13)

Primer:5′-荧光-GAG GAA AGG GAA GGG AAA GGA AGG(SEQ ID No.7)

上述测序胶实验结果表明，dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI或XX；dATP可逆终止剂XI,IX,XV或XIX和dGTP可逆终止剂VIII,X,XVIII或XXI当模板为连续多个相同碱基时，一次均只能延伸一个可逆终止剂,且延伸效率几乎均为100％。

为了进一步验证此类可逆终止剂参与DNA延伸、断裂以及参与多次测序循环的可行性，我们选用连续六个G的模板以dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI或XX为模型化合物，相应的测序胶实验结果如图15所示,其中，图15a的1-9泳道分别表示：24nt，25nt，第一次延伸，第一次断裂，第二次延伸，第二次断裂，第三次延伸，第三次断裂，第四次延伸；使用dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI或XX顺利地进行到第四次延伸，每次均只延伸一个，延伸完全，每次均可完全断裂。图15b的1-7泳道分别表示：24nt，25nt，第四次延伸，第四次断裂，第五次延伸，第五次断裂，第六次延伸。在连续6个G的模板上，dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI或XX一次均只延伸一个，可延伸6次，每次延伸和断裂的产率都很高。

模板序列如下：

Primer:5′-荧光-GAG GAA AGG GAA GGG AAA GGA AGG(SEQ ID No.7)

Template:3′-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCGGGGGGCGCCATGTGC(SEQ ID No.14)

该结果证明，该可逆终止剂一次只延伸一个，其效率为100％，以100％效率断裂后，可再次延伸，共进行6次延伸。每次延伸、断裂效率均接近100％。

进一步的，本实施例还验证了当选用模板为ATCG四个碱基时，将四种可逆终止剂混合均匀全部加入延伸体系，我们发现四个可逆终止剂依次参与DNA链延伸、断裂，一次只延伸一个可逆终止剂，实验测出的模板序列与实际序列完全一致。结果如图16所示，其中各泳道1-9分别为：24nt,25nt，dUTP延(A)，断，dATP延(T),断，dGTP延(C),断，dCTP延(G)。

模板序列如下：

Primer:5′-荧光-GAG GAA AGG GAA GGG AAA GGA AGG(SEQ ID No.7)

Template:3’-CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCATCGTTCGCCATGTGC(SEQ ID No.15)

在本发明特定选择的可逆终止剂中，采用任意四种不同荧光素标记、不同碱基的可逆终止剂用于上述实验，其结果均与上述实验结果一致，均能实现一次只延伸一个，延伸效率100％的效果。

实施例5 可逆终止剂参与DNA延伸-断裂循环测序实验验证

为了进一步验证该类可逆终止剂用于DNA测序的可行性，我们在玻璃表面模拟真实的二代测序过程。首先将玻璃表面活化使之羟基化，然后与APTES反应，得到使玻璃表面含大量的活性官能团氨基，氨基再进一步与水溶性双功能连接单元反应的羧基活性酯反应，以酰胺键与玻璃表面相连，连接单元的另一端叠氮(或炔基)与5′-N3(或炔基)以点击化学反应相连。在此过程中，连接单元的水溶性有助于得到均相的反应体系，有利于提高后续的表面扩增表面放大以及延伸等反应效率，同时双功能连接单元的引入，避免了连接单元的两端均可能与玻璃表面相连。之后待测模板DNA信息在恒温条件下得以大量扩增，形成可用于测序的流通池反应器芯片，等温扩增过程有利于固定于玻璃表面的DNA稳定性，有效避免了由于温度频繁变化而导致固定在玻璃表面的DNA脱落，从而影响后续的测序过程。

初步实验结果表明，我们的等温扩增表面放大技术可获得15万DNA cluster/mm²,能够满足DNA合成测序的要求。相应地，Illumina芯片的密度为11万/mm².

本实施例的DNA合成测序方法如图3所示，按照实施例2所述方法扩增后的产物进行DNA延伸和断裂循环测序，所采用的可逆终止剂为：dUTP可逆终止剂XIV,XIII,VI XVII中的任意一种；dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI，XX中的任意一种；dATP可逆终止剂XI,IX,XV，XIX中的任意一种和dGTP可逆终止剂VIII,X,XVIII，XXI中的任意一种。

具体延伸、断裂等测序循环步骤如下所述：

(1)延伸

将经过表面放大的玻片用TE冲洗一遍，晾干后滴加4μL Pe(30μM)，60℃下保持5min；将用于延伸反应的混合溶液(具体组成及浓度如下所述)(20μL)滴加于玻片表面；并在65℃保持15min，使四个不同碱基的可逆终止剂在该体系中发生延伸反应，然后用TE缓冲液(10mM Tris-HCl and 1mM EDTA,pH＝8.0)冲洗三遍；

延伸反应溶液成分如下：

9°N buffer 7μL；NaCl(1M)1μL；9°N酶0.6μL；dUTP可逆终止剂XIV,XIII,VI或XVII(0.5mM)0.8μL；dATP可逆终止剂XI,IX,XV或XIX(0.5mM)0.8μL；dCTP可逆终止剂XII,VII,XVI或XX(0.1mM)4μL；dGTP可逆终止剂VIII,X,XVIII或XXI(0.2mM)2μL；ddH2O 3.8μL(每一种可逆终止剂在延伸体系中的浓度均为0.02mM)。

(2)可裂解连接单元断裂

将延伸反应之后残余的液体吸干，调节溶液的pH值，并加入断裂用化学试剂(酸敏感连接单元用酸性溶液；二硫键用DTT；偶氮键用连二亚硫酸钠),在65℃下保持5min，使参与延伸后连接在DNA链上的可逆终止剂中含有的可裂解连接单元键断裂，然后用TE buffer冲洗两遍；从而除去标记在碱基上的荧光素，重复上述延伸、成像、断裂步骤，从而完成多次测序循环。在23次延伸-断裂循环过程中第1,5,10,15,20次循环的延伸(左)和断裂(右)荧光照片如图4和图5所示。图中每一个亮点代表一个DNA簇，DNA簇的平均直径约0.8μm。

表面放大的玻片在没有进行延伸反应情况下的荧光信号，即背景信号，如图6所示。分别用四个通道观察荧光信号，图6中的数字表示荧光信号强度，图6a-d的荧光信号强度分别为4.7,4.7,4.4,4.6。分析延伸产物和断裂产物的荧光信号强度时，已扣除背景信号。

采用模板为T3获得的荧光信号如图7所示，图7a为用dATP可逆终止剂XI,IX,XV或XIX延伸的荧光信号；图7b为用断裂用化学试剂溶液处理后的荧光信号；图7c为不用断裂用化学试剂溶液处理，仅用荧光淬灭试剂处理再加dATP可逆终止剂XI,IX,XV或XIX观察到的荧光信号。图7的实验结果表明，延伸后用荧光淬灭试剂处理后，并且再次加入延伸反应的试剂，发现荧光信号几乎没有变化，说明延伸反应后如果不加断裂用化学试剂溶液将连接单元断裂，第二个可逆终止剂将不能继续延伸。

图8为四种不同模板(T1、T2、T3、T4)条件下DNA链参与多次延伸-断裂后的荧光强度。它们对应四个模板第一个参与延伸的可逆终止剂分别是dUTP可逆终止剂，dGTP可逆终止剂，dATP可逆终止剂和dCTP可逆终止剂，在此选择四个模板(T1,T2,T3,T4)分别用来分析四种荧光强度参与DNA延伸-断裂多次测序循环(23cycles)的变化。连接单元断裂后体系的荧光信号强度如图8所示，荧光信号数据如图9所示。图10为多次测序循环主次信号比值(信噪比)。

如果把断裂产率定义为：1-FL(断裂)/FL(延伸)。根据图9的数据可以计算断裂产率，其中最低的断裂产率是模板T1的第13次延伸-断裂，1-4.6/157.8＝97.08。因此断裂产率>97％。

对图10中数据进行线性拟合，得到如下拟合方程：

T1：y＝32.26-0.36x(U/G)；y＝33.67-0.32x(U/A)；y＝26.2-0.33x(U/C)；

T2：y＝27.65-0.24x(G/U)；y＝35.42-0.43x(G/A)；y＝34.97-0.30x(G/C)；

T3：y＝31.06-0.29x(G/C)；y＝28.09-0.06x(A/G)；y＝31.91-0.20x(A/C)；

T4：y＝32.86-0.37x(C/U)；y＝30.01-0.34x(C/G)；y＝31.24-0.35x(C/A)。

若以y＝2(即信噪比为2)为碱基读取所需信噪比的下限，根据拟合结果可以得出结论，该体系条件下DNA测序读长至少为73，而如果是双端测序，其读长至少为146。

准确率：

在本实施例中测序的218个DNA簇中，仅有两个读取的模板信息序列有误。

正确的序列应为：

5’-CAACAACAACAACAACAACAACAACAAGCCTGTACCTAAAGTTGGCCACACCGCATTCGAACGTAGCTA CGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(T2)；

实际读取的序列(SEQ ID No.16)：

5’-CAACAACAACAACAACAACAACAACAAGCCTGTACCTAAAGTTGGCCACACCGCATTCGAACGTAGCTA CGATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；

其中加粗标注的为读取的碱基(23nt)。错误序列只有最后两个碱基不对(应为GA,读取为AC)，准确率为1-2×2/(218×23)＝99.92％。

图11为四色荧光可逆终止剂在等温扩增后不同密度DNA簇玻璃表面的DNA延伸结果。从该图可见，在不同的反应条件下可得到不同密度的固定于玻璃表面的DNA簇，所以在实际测序中可根据需要对固定在玻璃表面DNA簇的密度进行调节从而满足不同实验的实际需求。

通量估算：本发明中目前使用的玻片尺寸为4×4mm，一个DNA簇的尺寸约为0.8μm。从目前已有的实验结果来看，玻片上DNA簇密度为150,000个/mm².如果我们的流通池的表面积与Illumina的相同(Illumina流通池表面积为36cm²),那么DNA簇总数(即reads)为540M(Illumina为400M)。现阶段已经达到的读长为150，则测序通量可达81G(Illumina为120G)。总之初步的实验结果表明，我们表面放大等温扩增技术能够达到的DNA簇密度高于Illumina在售商品。

本发明比较了5种水溶性双功能连接单元用于本发明所述的DNA合成测序方法，它们均能够很好地将DNA链固定于玻璃表面，并有效地实现后续的多次延伸断裂测序循环。并且本实施例再次证明经过优化的可逆终止剂完全可以做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂，完美解决了3′-OH未保护可逆终止剂当模板为连续多个相同碱基时，很难做到一次只延伸一个核苷酸的效果。而如Science,2008,320,106-109.报道的二硫键可逆终止剂当模板为连续多个相同碱基时，一次会延伸一个、两个甚至三个可逆终止剂。

本实施例所述实验结果，对于基于酸敏感、偶氮连接单元的可逆终止剂，均能够实现一次只延伸一个的实验结果。并且同样可以在玻璃表面实现多次延伸，得到极为类似的信噪比、读长以及准确率。

以上实施例采用了一种DNA合成测序系统，如图12所示，包括流通池反应器，流路系统，控制系统，检测系统和图像数据处理系统；

所述流通池反应器，流通池反应器包括采用水溶性双功能连接单元连接了引物的基体；所述基体材料可以是玻璃、高分子材料等，用于固定多条DNA链并形成一个适合合成测序用的反应容器；

流路系统，用于可控地操控各种试剂在流通池腔室内的进出；

所述控制系统包括温度控制系统和pH控制系统；温度控制系统，用于调节和维持流通池腔室内的温度；

pH值控制系统，用于调节测序过程中体系的酸碱度；

光学系统，包括激光光源，所述光学系统用于激发荧光；

检测器系统，用于检测和记录荧光信号；

图像数据处理系统，用于对延伸反应前后的荧光图像进行比对。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> DNA合成测序方法与测序系统

<130> DAG33001

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 1

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 2

caacaacaac aacaacaaca acaacaa 27

<210> 3

<211> 114

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 3

caacaacaac aacaacaaca acaacaatta ctacgaagct acatcaagtt agtagttttc 60

gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt tttt 114

<210> 4

<211> 114

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 4

caacaacaac aacaacaaca acaacaagcc tgtacctaaa gttggccaga caccgcattc 60

gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt tttt 114

<210> 5

<211> 115

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 5

caacaacaac aacaacaaca acaacaaagt gacgatctgc cggattgccg ttggtacttc 60

gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt ttttt 115

<210> 6

<211> 115

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 6

caacaacaac aacaacaaca acaacaacag acgttggctg taccagttac gcatcggttc 60

gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt ttttt 115

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 7

gaggaaaggg aagggaaagg aagg 24

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 8

ctcctttccc ttccctttcc ttccgtcga 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 9

ctcctttccc ttccctttcc ttccggcga 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 10

ctcctttccc ttccctttcc ttcctacga 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 11

ctcctttccc ttccctttcc ttccttcga 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 12

ctcctttccc ttccctttcc ttccctcga 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 13

ctcctttccc ttccctttcc ttcccccga 29

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 14

ctcctttccc ttccctttcc ttccgggggg cgccatgtgc 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 15

ctcctttccc ttccctttcc ttccatcgtt cgccatgtgc 40

<210> 16

<211> 115

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> artificial sequence

<400> 16

caacaacaac aacaacaaca acaacaagcc tgtacctaaa gttggccaac caccgcattc 60

gaacgtagct acgatctctc ctttcgcctc cgcatttttt tttttttttt ttttt 115