亲疏水选择性修饰的高密度生物芯片制备方法及生物芯片与流程

1.本发明是关于生物芯片技术领域，特别是关于一种亲疏水选择性修饰的高密度生物芯片制备方法及利用该高密度生物芯片制备方法制备的生物芯片。


背景技术：

2.自90年代以来，生物芯片技术作为一项融合微电子学、材料学、生物学、化学、物理学和计算机科学为一体的高度交叉的新技术，已发展成为生命科学研究中必不可少的工具之一。该技术可将大量探针固定在固相支持物上，可实现对目标生物分子(核酸、蛋白等)的高通量、大规模检测，被广泛应用在疾病诊断、疫苗研制和新药开发等领域。
3.制备生物芯片的基础和关键是固相载体材料(基底)的研制。目前，生物芯片的基底材料通常采用膜材料和玻片，其中，膜材料如尼龙膜、硝酸纤维素膜或聚丙烯膜等。然而，这些基材材料在制备生物芯片时存在一些缺点，如膜材料的多孔性虽然可提高生物分子的固载量，但是也存在点阵密度低、点易扩散、背景噪音大、杂交速度慢的缺点；又如玻片在修饰时存在均一性和重复性相对差等缺点，并且进口已修饰的玻片基底价格较贵。另外，目前在利用上述基底材料制备生物芯片时主要采用先合成后点样方法，而该方法一般使用相对亲水的基底，但存在点样后样点的面积较大、样点的密度不高，且样点间容易交叉污染等缺点。
4.如何制备出高密度样点的生物芯片且避免交叉污染是亟需解决的问题。
5.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种亲疏水选择性修饰的高密度生物芯片制备方法，其不仅能够制备出具有高密度样点的生物芯片，而且还能够避免点样后样点间的交叉污染。
7.为实现上述目的，本发明的实施例提供了一种亲疏水选择性修饰的高密度生物芯片制备方法，所述高密度生物芯片制备方法包括：
8.在硅片基底表面制备二氧化硅层；
9.基于亲疏水性表面图案制备掩膜板，并利用所述掩膜板对覆有二氧化硅层的硅片基底表面进行光刻处理，形成若干个覆盖光刻胶的区域；
10.利用疏水硅烷对硅片基底表面未覆盖光刻胶的区域进行疏水性修饰，形成疏水性表面；
11.去除光刻胶并利用亲水硅烷进行亲水性修饰，形成亲水性表面；
12.通过点样将氨基修饰的dna分子固定到所述具有疏水性表面和亲水性表面的硅片基底上，形成生物芯片；
13.其中，所述亲疏水表面图案包括：
14.亲水性表面和疏水性表面的排布方式；
15.亲水性表面的形状、面积大小；
16.疏水性表面的形状、面积大小。
17.在本发明的一个或多个实施方式中，所述在硅片基底表面制备二氧化硅层包括：
18.通过热氧化或溅射在硅片基底表面制备二氧化硅层。
19.在本发明的一个或多个实施方式中，在硅片基底表面制备二氧化硅层之前，还包括：
20.利用hf清洗硅片基底表面的杂质及自然氧化的二氧化硅，在清洗后利用氮气吹干并在180℃的条件下烘干。
21.在本发明的一个或多个实施方式中，在硅片基底表面制备二氧化硅层之后，还包括：
22.利用食人鱼溶液在90℃的条件下清洗硅片基底。
23.在本发明的一个或多个实施方式中，所述去除覆盖光刻胶的区域上的光刻胶包括：
24.通过丙酮浸泡硅片基底去除光刻胶并在光刻胶去除后利用超纯水冲洗和氮气吹干。
25.在本发明的一个或多个实施方式中，在形成亲水表面之后，还包括：
26.利用戊二醛磷酸盐溶液对硅片基底进一步修饰若干小时并在修饰完成后利用超纯水洗干净吹干。
27.在本发明的一个或多个实施方式中，所述利用疏水硅烷对硅片基底进行疏水性修饰包括：
28.利用含有三氯硅烷的二甲苯溶液进行疏水性修饰。
29.在本发明的一个或多个实施方式中，所述利用亲水硅烷进行亲水性修饰包括：
30.利用含有3％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液进行亲水性修饰。
31.在本发明的一个或多个实施方式中，所述亲水性表面与疏水性表面在同一平面上相间排布。
32.本发明还揭示了一种生物芯片，所述生物芯片由上述所述的高密度生物制备方法制备。
33.与现有技术相比，根据本发明实施方式的高密度生物芯片制备方法，使制备出的生物芯片具有疏水性表面和亲水性表面，并且疏水性表面和亲水性表面在同一平面上相间排布，使得点样后，亲水性表面周围的疏水性表面可以约束液滴向周围扩散，因而亲水性表面可以很小，使生物芯片的密度可以达到很高。同时，由于疏水性表面的约束作用，一方面能够较好地避免点样后样点间的交叉污染，减少点样后的封闭步骤，另一方面能够使亲水样点的大小更均匀，面积一致性高，可以较少咖啡环现象。
附图说明
34.图1是根据本发明一实施方式的高密度生物芯片制备方法流程图；
35.图2是根据本发明一实施方式的高密度生物芯片制备流程图；
36.图3是根据本发明一实施方式的高密度生物芯片结构示意图；
37.图4是根据本发明另一实施方式的高密度生物芯片结构示意图。
具体实施方式
38.下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
39.除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
40.如图1至图2所示，根据本发明优选实施方式的一种亲疏水选择性修饰的高密度生物芯片制备方法，不仅能够制备出具有高密度样点的生物芯片，而且还能够避免点样后样点间的交叉污染。具体地，亲疏水选择性修饰的高密度生物芯片制备方法包括如下步骤：
41.s100，在硅片基底表面制备二氧化硅层；
42.具体地，硅片基底具有纯度高、洁净度高、平整度好、耐腐蚀、加工工艺成熟等优点，因而，选择硅片基底制备生物芯片，并且利用硅片基底制备生物芯片可避免出现使用膜材料、玻片等基底制备生物芯片所存在的缺点。
43.在制备生物芯片时，首先在硅片基底表面制备二氧化硅层，该二氧化硅层用作亲水材料，并且为后续修饰提供硅基基团，如图2中2b所示，a为硅片基底，b为二氧化硅层。二氧化硅层可通过如下方式制备：通过热氧化方法在硅片基底表面制备二氧化硅层。当然，其他实施例中，也可通过溅射方式在硅片基底表面制备二氧化硅层，即在硅片基底表面溅射一层二氧化硅。本实施例中，二氧化硅层的厚度优选20～500nm。通过将二氧化硅层的厚度设置在上述范围内，便于后续在制备生物芯片过程中提供亲水材料及修饰时提供硅基基团。
44.进一步地，在硅片基底表面制备二氧化硅层之前，还需对硅片基底的表面进行清洗，以去除硅片基底表面的杂质和自然氧化的二氧化硅。实施时，可通过如下步骤对硅片基底的表面进行清洗：首先，利用hf对硅片基底进行清洗，以洗去硅片基底表面的杂质及二氧化硅。最后，在清洗完成后利用氮气进行吹干，并在180℃的条件下烘干3小时。通过对硅片基底表面进行清洗处理，利于在硅片基底表面生长二氧化硅层。
45.s200，基于亲疏水性表面图案制备掩膜板，并利用所述掩膜板对覆有二氧化硅层的硅片基底表面进行光刻处理，形成若干个覆盖光刻胶的区域；
46.具体地，亲疏水性表面图案用于记录亲水性表面和疏水性表面的一些信息，如记录亲水性表面和疏水性表面的排布方式、亲水性表面的形状和大小、疏水性表面的形状和大小等等，这些可根据实际需求进行设计。本实施例中，亲水性表面图案中亲水性表面与疏水性表面在同一平面上相间排布，亲水性表面之间相互孤立。结合图3和图4所示，亲水性表面与疏水性表面呈阵列排布，其中，b为疏水性表面，c为亲水性表面。
47.本实施例中，亲水性表面的形状可为圆形、椭圆形、方形、多边形或其他形状，可根据实际需求进行选择。同样地，疏水性表面的形状可为圆形、椭圆形、方形、多边形或其他形状，可根据实际需求进行选择。
48.进一步地，当根据实际需求设计出亲疏水性表面图案后，基于该亲疏水性表面图案制备对应的掩膜板，并利用该掩膜板对覆盖有二氧化硅层的硅片基底表面进行光刻处理，以在硅片基底表面形成有若干个覆盖光刻胶的区域，如图2中2c和2d所示，经光刻处理后形成了光刻胶覆盖区域n。该覆盖光刻胶的区域用于后续制备亲水性表面。而硅片基底表
面未覆盖光刻胶的区域用于后续制备疏水性表面。
49.本实施例中，根据亲疏水性表面图案中亲水性表面的形状、大小及排布方式制作对应的石英或苏打玻璃掩膜板。当制作掩膜板后，进一步在覆有二氧化硅的硅片基底表面涂覆光刻胶，并利用该掩膜板进行光刻处理。在光刻过程中，经过光照处理后的光刻胶会发生化学反应，提高抗蚀能力，而未经光照处理后的光刻胶保持原样。进一步进行显影和竖膜处理，以在硅片基底表面形成若干个覆盖光刻胶的区域。
50.进一步地，当在硅片基底表面制备出二氧化硅层后，且在基于亲疏水性表面图案制备掩膜板之前，还通过食人鱼溶液对硅片基底在90℃温度条件下进行30min清洗。通过采用食人鱼溶液对硅片基底进行清洗，主要是用作亲水处理。这里的食人鱼溶液为98％浓硫酸和30％过氧化氢以体积比3:1混合而成。
51.s300，利用疏水硅烷对硅片基底表面未覆盖光刻胶的区域进行疏水性修饰，形成疏水性表面；
52.具体地，如图2中的2e所示，当在硅片基底表面形成了覆盖光刻胶的区域后，进一步利用疏水硅烷对未覆盖光刻胶的区域进行疏水性修饰，以形成疏水性表面，图2e中斜线部分所示。实施时，利用含有三氯硅烷的二甲苯溶液进行疏水性修饰，并且以修饰30min为最佳。
53.s400，去除覆盖光刻胶的区域上的光刻胶并利用亲水硅烷进行亲水性修饰，形成亲水性表面；
54.具体地，当利用疏水硅烷对未覆盖光刻胶的区域进行疏水性修饰，以制备疏水性表面时，覆盖光刻胶的区域在光刻胶的保护下而未被疏水性修饰，无法形成疏水性表面。
55.进一步地，在制备亲水性表面时，首先将光刻胶去除，以使待制备亲水性表面的区域暴露。实施时，可通过丙酮去除光刻胶。在去除光刻胶时，可利用丙酮浸泡硅片基底30min，并在光刻胶取出后利用超纯水清洗硅片基底，并在清洗完成后利用氮气吹干处理。
56.进一步地，当去除光刻胶后，利用亲水硅烷对去除光刻胶的区域进行亲水性修饰，以形成亲水性表面，图2f中竖线部分。实施时，可利用含有3％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液进行亲水性修饰，以形成亲水性表面。当完成亲水性修饰后，利用超纯水进行清洗，以去除残留的丙酮溶液，并烘干备用。
57.当然，为了达到更好的修饰效果，还可进一步利用5％的戊二醛磷酸盐缓冲溶液对硅片基底进一步修饰一定时间，并在修饰完成后利用超纯水洗净，并利用氮气吹干备用。
58.s500，通过点样将氨基修饰的dna分子固定到所述具有疏水性表面和亲水性表面的硅片基底上，形成生物芯片。
59.具体地，当在硅片基底表面制备出疏水性表面和亲水性表面后，进一步利用点样仪将氨基修饰后的dna分子固定到上述具有疏水性表面和亲水性表面的硅片基底上，以制备成生物芯片。实施时，可通过nano-plotter 2.1点样仪进行点样处理。本实例中，经氨基修饰后的dna分子如下所示：
60.p1 cattggaaacgatgattaataccag
61.p2 gcaagacggaaagacc
62.p3 caagacggcaagaccc
63.p4 caagacgggaagaccc
64.p5 caagacggagagaccc
65.p6 caagctcgtgaatgataagatag
66.p7 cttctcttaccaccaatgcg
67.当然，也可根据实际需求进行选择。
68.进一步地，当点样完成后，还需将生物芯片在一定的温度和湿度条件下进行过夜固定，并在过夜固定后利用去离子水清洗若干次，如清洗3次等。经处理后的生物芯片可用于检测目标核酸。
69.以下以两个实施例对本发明所揭示的生物芯片制备方法进行详细地说明：
70.实施例一
71.如图3所示为生物芯片中亲水性表面与疏水性表面的形状、大小和排布示意图，a为硅片基底，b为疏水性表面，c为亲水性表面。其中，亲水性表面呈圆形，记为亲水圆点，该亲水圆点其呈整列排布，亲水圆点以外的区域为疏水性表面。本实施例中，亲水圆点的直径优选10μm～1mm，相邻亲水圆点之间的中心距离优选10μm～1mm。
72.为使制备出的高密度生物芯片也具有如上所述的亲水性表面和疏水性表面，可通过如下步骤进行制备：
73.(1)对硅片基底进行清洗，即利用hf洗去硅片基底表面杂质和自然氧化的二氧化硅，并在清洗完成后利用氮气吹干，进一步在氮气吹干后在180℃条件下烘干3小时。
74.(2)在硅片基底表面制备二氧化硅层，即利用热氧化方法在硅片基底表面制备厚度为200nm的二氧化硅层。
75.(3)利用食人鱼溶液对硅片基底进行清洗，即利用食人鱼溶液在90℃条件下清洗30min。
76.(4)基于亲疏水性表面图案制备掩膜板，即根据亲疏水性表面图案制备对应的石英或苏打玻璃掩膜板。该掩膜板的制备可利用半导体领域中掩膜板的加工流程进行制备。
77.(5)利用掩膜板进行光刻、显影和竖膜，即按照半导体领域的常规加工流程和正负胶的使用，进行光刻、显影和坚膜，以在硅片基底表面形成呈阵列排布的光刻胶覆盖区域。
78.(6)疏水性修饰，即利用疏水硅烷对硅片基底进行疏水性修饰30min，以在硅片基底表面形成疏水性表面。
79.(7)去除光刻胶，即利用丙酮浸泡硅片基底，以去除硅片基底表面的光刻胶，并在去除光刻胶后，利用超纯水冲洗，同时利用氮气进行吹干。
80.(8)亲水性修饰，即利用含有3％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液，对去除光刻胶后的硅片基底进行亲水性修饰，并在修饰后利用超纯水冲洗干净，烘干备用。
81.(9)利用5％的戊二醛磷酸盐缓冲溶液，对硅片基底进行进一步修饰若干个小时，并在修饰完成后利用超纯水冲洗干净，并在洗净后利用氮气吹干备用。
82.(10)点样处理，即利用点样仪将氨基修饰后的dna分子固定到上述处理后的硅片基底上。点样完成后，在一定湿度和温度条件过夜固定。进一步在过夜固定后利用去离子水冲洗若干次，并利用氮气吹干。即可利用该生物芯片检测目标核酸。
83.实施例二
84.如图4所示为生物芯片中亲水性表面与疏水性表面的形状、大小和排布示意图，a为硅片基底，b为疏水性表面，c为亲水性表面。其中，亲水性表面呈方形，记为亲水方点，该
亲水方点其呈整列排布，亲水方点以外的区域为疏水性表面。本实施例中，亲水方点的边长优选10μm～1mm，相邻亲水方点之间的中心距离优选10μm～1mm。
85.本实施例中，高密度生物芯片制备方法与实施例一不同的是，在硅片基底表面制备二氧化硅层时采用溅射方式。
86.本发明还揭示了一种生物芯片，采用上述所述的生物芯片制备方法制备而成。
87.本发明所述的生物芯片制备方法，使制备出的生物芯片具有疏水性表面和亲水性表面，并且疏水性表面和亲水性表面在同一平面上相间排布，使得点样后，亲水性表面周围的疏水性表面可以约束液滴向周围扩散，因而亲水性表面可以很小，使生物芯片的密度可以达到很高。同时，由于疏水性表面的约束作用，一方面能够较好地避免点样后样点间的交叉污染，减少点样后的封闭步骤，另一方面能够使亲水样点的大小更均匀，面积一致性高，可以较少咖啡环现象。
88.前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。