一种具有抗炎活性的黄大茶多糖及其制备方法和应用、抗炎药物组合物

1.本发明涉及黄大茶活性物质应用技术领域，尤其涉及一种具有抗炎活性的黄大茶多糖及其制备方法和应用、抗炎药物组合物。


背景技术：

2.茶(camellia sinensis)是山茶科山茶属多年生常绿植物。用其叶片和嫩枝通过特殊工艺制成的茶叶享有独特的风味魅力、多元的保健功能、深厚的文化底蕴而风靡全球，成为世界三大无酒精饮料之一，消费量仅次于饮用水。文献记载茶叶作为药用已有几千年的历史，饮茶具有“止渴、消食、除痰、少睡、利尿、明目、益思、除烦、去腻”之功效。现代药理学研究表明，多糖是茶叶发挥生物活性的重要成分之一，其不仅具有抗炎、免疫调节等多种生物活性，而且在预防肥胖引起的慢性炎症和代谢综合征方面表现出良好的效果，显示出茶多糖在抗炎新药开发方面具有广泛的应用前景。
3.茶多糖在茶中的含量与茶叶的老嫩程度及加工方式有关，一般粗老叶高于嫩叶。充分利用茶叶在种植和生产过程中产生的不宜饮用的粗老茶叶，提取其中极具开发潜能的生物活性物质多糖可有效提高茶叶的经济附加值。黄大茶是我国特有的茶类，种植资源丰富，属夏秋茶，原料叶是一芽三至六叶的粗老叶，资源非常丰富。近期研究发现，黄大茶水提物中的多糖含量较红茶、绿茶、黑茶中高。但目前有关黄大茶发挥其功能活性的物质基础尚不清楚，黄大茶中多糖的主要活性组分及功效亟待明确。
4.多糖的化学结构是决定其发挥生物活性的基础。目前涉及的霍山黄大茶多糖几乎都是从霍山黄大茶中提取的粗多糖，迄今仍不清楚霍山黄大茶抗炎活性多糖的化学组成和结构，更缺乏适合的提取纯化工艺制备化学结构明确、组成成分均一的抗炎活性多糖，这些都限制了霍山黄大茶多糖抗炎相关保健品和新药的研发。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种具有抗炎活性的黄大茶多糖及其制备方法和应用、抗炎药物组合物，所述黄大茶多糖具有特定的糖苷键结构，且具有优异的抗炎活性。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种具有抗炎活性的黄大茶多糖，所述黄大茶多糖的可重复一级结构单元含有t-β-d-galpa-(1
→
、
→
4)-α-d-galpa-(1
→
、
→
4)-β-d-galp-(1
→
、β-d-galp-(1
→
、
→
2)-β-l-rhap-(1
→
、
→
2,4)-β-l-rhap-(1
→
、α-l-araf-(
→
1、
→
5)-α-l-araf-(1
→
、
→
4)-β-d-glcp-(1
→
九种糖残基，所述糖残基的连接方式如式1所示：
[0008][0009]
优选的，所述黄大茶多糖的相对分子质量为2.86
×
104da，所述黄大茶多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸组成，所述鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸的摩尔比为8.05:1.66:11.77:3.96:58.02。
[0010]
本发明提供了上述技术方案所述具有抗炎活性的黄大茶多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
将霍山黄大茶进行脱色脱脂后，得到霍山黄大茶粉末；
[0012]
将所述霍山黄大茶粉末与水混合，进行水提取，得到黄大茶水提物；
[0013]
将所述黄大茶水提物与乙醇混合，进行醇沉，得到黄大茶醇沉物；
[0014]
将所述黄大茶醇沉物依次进行脱蛋白和透析，得到黄大茶多糖提取液；
[0015]
将所述黄大茶多糖提取液进行阴离子交换柱层析，收集含多糖洗脱液，得到黄大茶多糖精提液；
[0016]
对所述黄大茶多糖精提液进行抗炎导向筛选，得到具有抗炎活性的多糖组分；
[0017]
将所述具有抗炎活性的多糖组分进行凝胶柱层析，得到具有抗炎活性的黄大茶多糖。
[0018]
优选的，所述水提取的温度为90～100℃、次数为2～3次，每次提取的时间独立为2～3h。
[0019]
优选的，所述醇沉过程中，乙醇的终浓度为80％，所述醇沉的温度为4℃，时间为12～24h。
[0020]
优选的，所述阴离子交换柱层析所用柱为deae cellulose de-52，上样浓度为50～100mg/ml，所述洗脱的方式为依次进行去离子水洗脱和nacl梯度洗脱；所述nacl梯度洗脱所用氯化钠溶液的浓度为0.1～0.4mol/l；洗脱的流速为2ml/min。
[0021]
优选的，所述凝胶柱层析所用柱为sephadex g-100，上样浓度为20～40mg/ml，洗脱液为水，洗脱的流速为0.5ml/min。
[0022]
本发明提供了上述技术方案所述黄大茶多糖或上述技术方案所述制备方法制备得到的黄大茶多糖在制备抗炎药物中的应用。
[0023]
本发明提供了一种抗炎药物组合物，包括黄大茶多糖和药学上可接受的辅料。
[0024]
优选的，所述药物组合物的口服剂型包括片剂、胶囊剂、含片、口服液、颗粒剂、丸剂或散剂。
[0025]
本发明提供了一种具有抗炎活性的黄大茶多糖，该黄大茶多糖结构新颖、具有明确的化学结构，且组成均一，可显著降低脂多糖引起的骨髓源巨噬细胞中的炎症因子的表达，而本身对正常的巨噬细胞无毒副作用，具有明显的抗炎功能。作为天然抗炎活性的多糖，解决了黄大茶在抗炎新药研发方面缺乏组成单一且结构明确的活性成分的问题，为黄大茶多糖抗炎作用的构效关系研究及抗炎症药物的研发奠定了可靠的物质基础。
[0026]
本发明提供了所述黄大茶多糖的制备方法，本发明经抗炎活性导向筛选，利用阴离子交换树脂结合凝胶柱层析的工艺相结合制备具有抗炎活性的黄大茶多糖，工艺条件温和、操作简单、环境友好，获得的多糖纯度高、结构稳定，最大程度地保持了多糖抗炎的活性，适合工业规模生产。
附图说明
[0027]
图1为黄大茶多糖lyp-s3的制备流程图；
[0028]
图2为黄大茶多糖lyp-s3的理化特征图；a.lyp-s3的uv扫描图；b.lyp-s3的hpgpc图；c.lyp-s3的ft-ir图；
[0029]
图3为黄大茶多糖lyp-s3的结构特征图；a.单糖标准品的hplc图；b.lyp-s3单糖组成的hplc图；c.lyp-s3的甲基化糖醇乙酸酯衍生物tic图；
[0030]
图4为黄大茶多糖lyp-s3的核磁图谱；a.氢谱；b.碳谱；c.hsqc谱；d.1h-1h cosy谱；e.hmbc谱
[0031]
图5为黄大茶多糖对炎症巨噬细胞表型的抑制作用图；a.黄大茶多糖对巨噬细胞的毒性和增殖影响；b.黄大茶多糖抑制巨噬细胞向促炎表型极化；c.黄大茶多糖促进巨噬细胞向抗炎表型极化；
[0032]
图6为黄大茶多糖lyp-s3对炎症因子表达的抑制作用图；a.lyp-s3促进巨噬细胞中抗炎基因表达水平；b.lyp-s3促进巨噬细胞中抗炎细胞因子分泌水平；c.lyp-s3抑制lps诱发的巨噬细胞中促炎基因表达水平；d.lyp-s3抑制lps诱发的巨噬细胞中促炎细胞因子分泌水平。
具体实施方式
[0033]
本发明提供了一种具有抗炎活性的黄大茶多糖，所述黄大茶多糖的可重复一级结构单元含有t-β-d-galpa-(1
→
、
→
4)-α-d-galpa-(1
→
、
→
4)-β-d-galp-(1
→
、β-d-galp-(1
→
、
→
2)-β-l-rhap-(1
→
、
→
2,4)-β-l-rhap-(1
→
、α-l-araf-(
→
1、
→
5)-α-l-araf-(1
→
、
→
4)-β-d-glcp-(1
→
九种糖残基，所述糖残基的连接方式如式1所示：
[0034][0035]
在本发明中，所述黄大茶多糖的相对分子质量为2.86
×
104da，所述黄大茶多糖由鼠李糖(rhap)、阿拉伯糖(araf)、半乳糖(galp)、葡萄糖(glcp)和半乳糖醛酸(galpa)组成，所述鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸的摩尔比为8.05:1.66:11.77:3.96:58.02。
[0036]
如图1所示，本发明提供了上述技术方案所述具有抗炎活性的黄大茶多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0037]
将霍山黄大茶进行脱色脱脂后，得到霍山黄大茶粉末；
[0038]
将所述霍山黄大茶粉末与水混合，进行水提取，得到黄大茶水提物；
[0039]
将所述黄大茶水提物与乙醇混合，进行醇沉，得到黄大茶醇沉物；
[0040]
将所述黄大茶醇沉物依次进行脱蛋白和透析，得到黄大茶多糖提取液；
[0041]
将所述黄大茶多糖提取液进行阴离子交换柱层析，收集含多糖洗脱液，得到黄大茶多糖精提液；
[0042]
对所述黄大茶多糖精提液进行抗炎导向筛选，得到具有抗炎活性的多糖组分；
[0043]
将所述具有抗炎活性的多糖组分进行凝胶柱层析，得到具有抗炎活性的黄大茶多糖。
[0044]
在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
[0045]
本发明将霍山黄大茶进行脱色脱脂后，得到霍山黄大茶粉末。在本发明中，所述脱色脱脂的过程优选包括：将霍山黄大茶于60℃烘干，粉碎，80目过筛；按料液比1g:20ml加入95％乙醇，在25℃、50rpm/min转速搅拌处理24h，抽滤，收集沉淀，得到霍山黄大茶粉末。
[0046]
得到霍山黄大茶粉末后，本发明将所述霍山黄大茶粉末与水混合，进行水提取，得到黄大茶水提物。在本发明中，所述霍山黄大茶粉末与水的料液比优选为1g:20ml，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程将物料混合均匀即可。
[0047]
在本发明中，所述水提取的温度优选为90～100℃，次数优选为2～3次，每次提取的时间独立优选为2～3h，更优选为2.5h；所述水提取优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的转速优选为50rpm/min。完成所述水提取后，本发明优选将所得物料循环抽滤3次，合并3次滤液，得到黄大茶水提物。
[0048]
得到黄大茶水提物后，本发明将所述黄大茶水提物与乙醇混合，进行醇沉，得到黄大茶醇沉物。本发明优选先将所述黄大茶水提物在65℃、0.09～0.10mpa真空度下减压浓缩至原体积的1/3～1/4，然后于4℃、10000rpm/min离心20min，沉淀弃去，收集上清液与乙醇混合，进行醇沉。
[0049]
本发明优选加入乙醇使乙醇的终浓度为80％，所述醇沉的温度优选为4℃，时间优选为12～24h。完成所述醇沉后，本发明优选将所得物料在4℃、10000rpm/min离心20min，收集沉淀，得到黄大茶醇沉物。
[0050]
得到黄大茶醇沉物后，本发明将所述黄大茶醇沉物依次进行脱蛋白和透析，得到黄大茶多糖提取液。在本发明中，所述脱蛋白的过程优选为向所述黄大茶醇沉物中加入水至完全溶解，采用sevag法脱蛋白6～8次。
[0051]
完成所述脱蛋白后，本发明优选先将所得产物在65℃、0.09～0.10mpa真空度下减压旋蒸(除去有机溶剂残留)，然后进行透析；所述透析所用透析袋截留分子量3500da；所述透析的时间优选为24h。
[0052]
完成所述透析后，本发明优选将所得产物进行冷冻干燥，得到黄大茶多糖提取液；所述冷冻干燥的温度优选为-50℃，压力优选为10pa，时间优选为48h。
[0053]
得到黄大茶多糖提取液后，本发明将所述黄大茶多糖提取液进行阴离子交换柱层析，收集含多糖洗脱液，得到黄大茶多糖精提液。在本发明中，所述阴离子交换柱层析所用柱优选为deae cellulose de-52，上样浓度优选为50～100mg/ml，所述洗脱的方式优选为所述洗脱的方式为依次进行去离子水洗脱和nacl梯度洗脱；所述nacl梯度洗脱所用氯化钠溶液的浓度为0.1～0.4mol/l；洗脱的流速优选为2ml/min；所述nacl梯度洗脱所用氯化钠
溶液的浓度优选依次为0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l和0.4mol/l。
[0054]
本发明优选采用苯酚-硫酸比色法检测阴离子交换柱层析所得洗脱液中多糖含量，收集含多糖洗脱液。本发明对所述苯酚-硫酸比色法的具体过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。
[0055]
检测阴离子交换柱层析所得洗脱液中多糖含量后，得到黄大茶多糖精提液，所述黄大茶多糖精提液包括lyp-w1、lyp-s1、lyp-s2、lyp-s3、lyp-s4五个组分。
[0056]
得到黄大茶多糖精提液后，本发明对所述黄大茶多糖精提液进行抗炎导向筛选，得到具有抗炎活性的多糖组分。在本发明中，所述抗炎导向筛选优选为使用黄大茶多糖精提液刺激预先用脂多糖lps诱导的c57bl/6j小鼠骨髓源巨噬细胞，筛选能够显著降低由脂多糖引起的细胞向炎症模型细胞极化的活性组分，得到具有抗炎活性的多糖组分。在本发明中，所述显著降低由脂多糖引起的细胞向炎症模型细胞极化的活性组分的判断原则为：与炎症模型组相比，可抑制炎症细胞分化率达到50～60％。
[0057]
得到具有抗炎活性的多糖组分后，本发明将所述具有抗炎活性的多糖组分进行凝胶柱层析，得到具有抗炎活性的黄大茶多糖。在本发明中，所述凝胶柱层析所用柱优选为sephadex g-100，上样浓度优选为20～40mg/ml，洗脱液为水，洗脱的流速优选为0.5ml/min。本发明通过凝胶柱层析进行脱盐提纯。
[0058]
在所述凝胶柱层析过程中，本发明优选采用苯酚-硫酸比色法测定所得洗脱液中多糖含量，收集含多糖洗脱液，进行真空冷冻干燥，得到黄大茶多糖。本发明对所述真空冷冻干燥的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。
[0059]
本发明提供了上述技术方案所述黄大茶多糖或上述技术方案所述制备方法制备得到的黄大茶多糖在制备抗炎药物中的应用。
[0060]
本发明提供了一种抗炎药物组合物，包括黄大茶多糖和药学上可接受的辅料。
[0061]
在本发明中，所述药物组合物的口服剂型优选包括片剂、胶囊剂、含片、口服液、颗粒剂、丸剂或散剂。
[0062]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0063]
实施例1
[0064]
(1)将霍山黄大茶于60℃下烘干，粉碎，80目过筛；按料液比1g:20ml加入95％乙醇，在25℃、50rpm/min转速下搅拌处理24h，抽滤过滤，收集沉淀，得到脱色脱脂的霍山黄大茶粉末；
[0065]
(2)将步骤(1)脱色脱脂的霍山黄大茶粉末按料液比1g:20ml与蒸馏水混合均匀，在90℃、50rpm/min转速下搅拌提取2.5h，抽滤过滤，收集滤液，重复2次，合并3次滤液，得到霍山黄大茶水提物；
[0066]
(3)将步骤(2)霍山黄大茶水提物于65℃、0.10mpa真空度下减压浓缩至原体积的1/3，于4℃、10000rpm/min下离心20min，沉淀弃去，收集上清液加入无水乙醇，使乙醇的终浓度为80％，4℃下沉淀24h后，于4℃、10000rpm/min下离心20min，收集沉淀，得到霍山黄大茶醇沉物；
[0067]
(4)取步骤(3)霍山黄大茶醇沉物，加入去离子水至完全溶解，利用sevag法脱蛋白6次，于65℃、0.10mpa真空度下减压旋转蒸除去有机溶剂残留，然后用截留分子量3500da的透析袋透析24h后，于-50℃、10pa条件下冷冻干燥48h，得到霍山黄大茶多糖提取液；
[0068]
(5)取步骤(4)霍山黄大茶多糖提取液，上阴离子交换树脂deae cellulose de-52柱，上样浓度为100mg/ml，先用去离子水洗脱得到lyp-w1组分，然后分别采用梯度浓度依次为0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l和0.4mol/l的nacl梯度溶液按2ml/min流速进行洗脱，通过苯酚-硫酸比色法检测洗脱液中多糖含量，收集含多糖洗脱液，得到霍山黄大茶多糖精提液lyp-s1、lyp-s2、lyp-s3、lyp-s4四个组分，共五个组分，其多糖含量依次为41.69
±
0.48％、38.75
±
0.53％、32.76
±
0.39％、49.03
±
0.55％、11.03
±
0.64％；
[0069]
(6)通过体外建立脂多糖lps诱导的骨髓源巨噬细胞的炎症反应模型，用步骤(5)获得的五个多糖组分预处理细胞，然后利用lps诱导细胞产生炎症反应，与lps诱导的炎症模型m1组相比，lyp-w1、lyp-s1、lyp-s2、lyp-s3、lyp-s4分别对m1型细胞的抑制分化率为14.57％、12.21％、34.13％、55.47％和28.22％，说明lyp-s3的抗炎效果最优，筛选能够极显著降低由lps引起的细胞向炎症细胞模型极化的活性组分lyp-s3；
[0070]
(7)取步骤(6)的lyp-s3上sephadex g-100柱，上样浓度为40mg/ml，以去离子水按0.5ml/min流速进行洗脱，通过苯酚-硫酸比色法检测洗脱液中多糖含量，收集含多糖洗脱液，真空冷冻干燥后，得到黄大茶多糖。
[0071]
结构分析及抗炎作用
[0072]
1、黄大茶多糖的理化特性分析如下：
[0073]
(1)黄大茶多糖lyp-s3基本理化指标的测定
[0074]
分别采用苯酚-硫酸法、羟基联苯法和考马斯亮蓝法对黄大茶多糖lyp-s3的碳水化合物、糖醛酸和蛋白质含量进行测定，结果表明，实施例1制备的黄大茶多糖lyp-s3中碳水化合物含量为57.36
±
2.78％，糖醛酸含量为39.43
±
1.07％，蛋白含量为0.75
±
0.14％。
[0075]
(2)黄大茶多糖lyp-s3紫外光谱检测
[0076]
取实施例1制备的黄大茶多糖lyp-s3，配制成1mg/ml溶液于紫外分光光度计上190～400nm波长范围内扫描，紫外扫描结果显示(图2中a)，lyp-s3在260nm和280nm均无吸收峰，表明lyp-s3几乎不含色素、蛋白和核酸。
[0077]
(3)黄大茶多糖lyp-s3的均一性和相对分子量测定
[0078]
采用高效凝胶渗透色谱(hpgpc)测定实施例1制备的黄大茶多糖lyp-s3的均一性和相对分子量，首先测定分子量分别为5000、25000、80000、150000、420000、670000da的dextran系列葡聚糖标准品在相同条件下的保留时间，利用agilent gpc数据分析软件制作分子量标准曲线，然后根据标准曲线计算多糖样品的相对分子量mw。
[0079]
测试条件：agilent 1260infinity系统；tsk g5000 pwxl(7.8
×
300mm)色谱柱；流动相双蒸水；进样量20μl；流速0.5ml/min；柱温30℃；示差折光检测器。
[0080]
结果如图2中b所示，lyp-s3为均一多糖，其相对分子质量为2.86
×
104da。
[0081]
(5)黄大茶多糖lyp-s3的特征基团分析
[0082]
采用红外光谱仪(ft-ir)分析实施例1制备的黄大茶多糖lyp-s3的特征基团，称取2.0mg干燥的多糖样品，用干燥的kbr粉末混合压片后在nicolet 67型傅里叶红外光谱仪上扫描分析，扫描范围为4000cm-1
～400cm-1
。
[0083]
结果如图2中c所示，lyp-s3具有多糖的特征峰，3402cm-1
附近出现的宽而强的峰归属于-oh的拉伸振动；2930cm-1
和1416cm-1
附近的峰归属于c-h的拉伸振动；1245cm-1
和1094cm-1
之间的峰归属于对称的c-h弯曲振动；1640附近出现的峰归属于多糖的吡喃糖环中c-o-c和c-o-h的c-o振动；1732cm-1
和1250cm-1
附近的峰归属于o-乙酰基的c＝o和c-o振动；895cm-1
附近的峰表明β-构型的存在。
[0084]
2、黄大茶多糖的化学结构鉴定如下：
[0085]
(1)黄大茶多糖lyp-s3的单糖组成
[0086]
采用thermo ics5000离子色谱系统，利用电化学检测器对lyp-s3的单糖组分进行分析检测。精确称量lyp-s3样品5mg(
±
0.05mg)，加入1ml 2mtfa酸溶液，121℃加热2小时，通氮气，吹干；加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2～3次；加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。另准确称取以下单糖标品，包括果糖(fuc)、鼠李糖(rha)、阿拉伯糖(ara)、半乳糖(gal)、葡萄糖(glc)、木糖(xyl)、甘露糖(man)、岩藻糖(fru)、核糖(rib)、半乳糖醛酸(gal-ua)和古罗糖醛酸(gul-ua)，各5mg，通过配制不同浓度梯度的单糖混标溶液，作为对照品分析。
[0087]
测试条件：采用dionex
tm
carbopac
tm
pa20(150*3.0mm，10um)液相色谱柱；进样量为5ul。流动相a(0.1m naoh)，流动相b(0.1m naoh，0.2m naac)，流速0.5ml/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0mina相/b相(95：5v/v)，30mina相/b相(80：20v/v)，30.1mina相/b相(60：40v/v)，45mina相/b相(60：40v/v)，45.1mina相/b相(95：5v/v)，60mina相/b相(95：5v/v)
[0088]
结果如图3中a所示(a.单糖标准品的hplc图)，lyp-s3由鼠李糖(rhap)、阿拉伯糖(araf)、半乳糖(galp)、葡萄糖(glcp)、半乳糖醛酸(galpa)组成，其摩尔比为8.05:1.66:11.77:3.96:58.02。
[0089]
(2)黄大茶多糖lyp-s3的糖苷键类型测定
[0090]
采用甲基化分析lyp-s3的糖苷键类型：
[0091]
称取20mg实施例1制备的lyp-s3溶解于2ml蒸馏水中，加入1ml100mg/ml的碳二亚胺(edc)于37℃下搅拌反应2h，在反应过程中用0.1mol/ml的hcl调节ph使其始终保持在4.7。将反应液平均分为两份，分别向反应液中加入1ml 30mg/ml的nabh4和1ml 30mg/ml的nabd4，反应3h。在反应过程中用4mol/ml的hcl溶液调节其ph始终保持在7.0。待反应结束后，将反应液经流水透析48h、浓缩、冷冻干燥得冻干样品。取冻干样品充分溶解于无水二甲基亚砜(dmso)中，随后加入在液氮中充分研磨的naoh粉末，超声50min(保持温度在40℃以下)，再加入1ml无水碘甲烷(边加边振荡)，超声水浴中反应1h，加适量蒸馏水终止反应，反应液经流水透析48h以完全除去多余的碘甲烷。将反应液浓缩、冷冻干燥后得甲基化多糖。取10mg完全甲基化的多糖置于安瓿瓶中，加入5ml 2mol/ml的三氟乙酸(tfa)，于110℃条件下反应8h，加入4ml甲醇溶液，旋蒸至完全除去tfa，该过程重复6次，得到完全水解产物。将完全水解后的产物溶于4ml蒸馏水中，加入40mg的nabh4在室温下还原3h，然后加入25％(v/v)的乙酸溶液中和反应液中多余的nabh4，向反应混合液中加入4ml甲醇溶液，旋蒸至完全除去nabh4，之后向反应液中加入乙酸酐，于100℃反应2.5h，加入1ml蒸馏水静置10min后加入二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相，取下层二氯甲烷相，上机进行gc-ms测定。
[0092]
检测条件：agilent gc7890a-msd5975c系统；hp-5毛细管柱(30mm
×
0.32mm
×
250nm)；进样口温度280℃；柱温程序为150℃保持1min后以10℃/min的速度升至200℃、之
后以4℃/min升至270℃；he流速1ml/min；离子源温度150℃；火焰离子检测器。
[0093]
结果如图3中b所示(b.lyp-s3单糖组成的hplc图)，黄大茶多糖甲基化产物在气相色谱中出现九个甲基化衍生物离子峰，根据每个峰的保留时间，通过联机检索各质谱图，确定各质谱的归属，并根据图3中c部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物的裂解规律归属质谱图中的初级碎片和次级碎片，解析获得霍山黄大茶多糖的糖苷键类型和摩尔比见表1。
[0094]
表1 lyp-s3的糖苷键类型和摩尔比
[0095][0096]
3、黄大茶多糖lyp-s3的化学结构特征分析
[0097]
采用nmr法进一步表征lyp-s3化学结构。称取50mg lyp-s3完全溶于95％的d2o中，冷冻干燥，反复交换三次，随后溶解于纯度99.9％的含有dss(葡聚糖硫酸钠盐)的d2o中，0.22μm水系膜过滤后，装入核磁管中，进行nmr测定。
[0098]
检测条件：vnmrs600超导核磁共振波谱仪；one nmrprobe(5mm)探头；1h谱工作频率599.81mhz；
13
c谱工作频率150.84mhz；55℃下分别测定1h谱、
13
c、cosy、hsqc、hmbc谱。
[0099]
结果如图4所示(a.氢谱；b.碳谱；c.hsqc谱；d.1h-1h cosy谱；e.hmbc谱)，黄大茶多糖是由
→
4)-β-d-glcp-(1
→
、
→
4)-β-d-manp-(1
→
和
→
4)-3-o-acetyl-β-d-manp-(1
→
九种糖残基组成的重复结构单元所构成，糖残基的化学位移分析见表2。所述糖残基的连接方式如下所示：
[0100][0101]
表2黄大茶多糖lyp-s3中c和h的化学位移
[0102][0103]
4、黄大茶多糖lyp-s3抗炎活性测定
[0104]
(1)细胞活力检测
[0105]
利用cck8检测实施例1制备的黄大茶多糖对小鼠骨髓来源的bmdms细胞活力的影响，取生长对数期的bmdms细胞，调整其细胞浓度(1
×
106个/ml)接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞悬液100μl，置于37℃、5％co2的培养箱中贴壁培养24h后，加入不同终浓度的黄大茶多糖组分lyp-w1、lyp-s1、lyp-s2、lyp-s3、lyp-s4各100μl(5、10、25、50、100、200、400、800μg/ml)每组浓度设置4个复孔，同时设置空白培养基对照组，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育24h之后，每孔加入10μl cck8试剂，同样培养条件下孵育2h，用酶标仪在450nm测定光密度吸光值(od)，细胞活力(％)＝od
加药组-od
空白组
/od
对照组-od
空白组
×
100％，设置对照组的细胞活力为100％。
[0106]
结果如图5中a所示(a.黄大茶多糖对巨噬细胞的毒性和增殖影响)，黄大茶多糖在800μg/ml浓度以下对巨噬细胞均无毒性，在200μg/ml时，可显著刺激巨噬细胞增殖。
[0107]
(2)bmdms炎症模型诱导与处理
[0108]
取对数生长期的bmdms细胞，调整细胞浓度为5
×
104个/ml接种于12孔细胞培养板
中，置于37℃、5％co2的培养箱中贴壁培养，细胞生长到80％后12h后，分别加入lps(100ng/ml)诱导24h分化成为经典活化的促炎巨噬细胞模型(bmdm-m1)；加入il-4(20ng/ml)诱导24h分化成为替代性活化的抗炎巨噬细胞模型(bmdm-m2)；加pbs到未分化的巨噬细胞(bmdm-m0)，作为对照组。向炎症细胞模型bmdm-m1中依次加入200μg/ml的黄大茶多糖lyp-w1、lyp-s1、lyp-s2、lyp-s3、lyp-s4继续培养24h，分别收集各组细胞，流式细胞仪检测细胞中m1型(f4/80
+
cd11c
+
)、m2型细胞(f4/80
+
cd206
+
)比例变化。
[0109]
结果如图5中b和c所示(b.黄大茶多糖抑制巨噬细胞向促炎表型极化；c.黄大茶多糖促进巨噬细胞向抗炎表型极化)，与lps诱导的炎症模型m1组相比，lyp-w1、lyp-s1、lyp-s2、lyp-s3、lyp-s4分别对m1型细胞的抑制分化率为14.57％、12.21％、34.13％、55.47％和28.22％，说明lyp-s3的抗炎效果最优。
[0110]
(3)黄大茶多糖lyp-s3抗炎活性验证
[0111]
为进一步验证lyp-s3的抗炎活性，利用rt-qpcr和elisa检测lyp-s3处理炎症细胞模型后的炎症因子表达。取对数生长期的bmdms细胞，调整细胞浓度为5
×
104个/ml接种于6孔细胞培养板中，37℃、5％co2的培养箱中贴壁12h后，加入lps(100ng/ml)诱导24h分化成为经典活化的促炎巨噬细胞模型(bmdm-m1)；加入il-4(20ng/ml)诱导24h分化成为替代性活化的抗炎巨噬细胞模型(bmdm-m2)；加pbs到未分化的巨噬细胞(bmdm-m0)，作为对照组。向炎症细胞模型bmdm-m1中分别加入不同浓度黄大茶多糖lyp-s3(50、100、200μg/ml)，继续培养24h,分别收集各组细胞和细胞上清液，采用rt-qpcr方法检测细胞中促炎因子(inos、tnf-α、il-1β、il-12、cd68、il-6)和抗炎因子(cd206、cd163、arg-1、il-10、fizz-1、ym-1)mrna表达水平；elisa检测细胞上清液中促炎因子tnf-α、il-1β和抗炎因子arg-1、il-10的浓度变化。
[0112]
结果如图6所示，图6中a和b表明(a.lyp-s3促进巨噬细胞中抗炎基因表达水平；b.lyp-s3促进巨噬细胞中抗炎细胞因子分泌水平)，黄大茶多糖lyp-s3可显著促进巨噬细胞中抗炎因子cd206、cd163、arg-1、il-10、fizz-1、ym-1表达水平。图6中c和d结果显示(c.lyp-s3抑制lps诱发的巨噬细胞中促炎基因表达水平；d.lyp-s3抑制lps诱发的巨噬细胞中促炎细胞因子分泌水平)，黄大茶多糖lyp-s3可显著降低lps诱发的促炎m1型巨噬细胞中inos、tnf-α、il-1β、il-12、cd68和il-6的mrna表达水平上调，具有剂量效应。
[0113]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。