酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素Nisin的方法及其应用

酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是一种酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的方法及其应用。


背景技术：

2.随着社会的发展与人民生活水平的提高，人们越来越追求更加健康、安全的饮食方式。食品防腐剂中化学类防腐剂的添加对人体的潜在危害，使得越来越多的人关注天然食品防腐剂的使用。
3.乳酸链球菌素(nisin)是一种高效、无毒的纯天然生物防腐剂，是fda公认安全的食品添加剂，在食品工业中得到了广泛的应用。目前，市场上普遍通过乳酸乳球菌发酵法，提取其代谢产物nisin。但往往工艺复杂，纯度较低。另外生产成本偏高也限制了nisin的广泛应用。
4.啤酒生产中易受乳酸杆菌和啤酒片球菌的侵袭，发生浑浊、酸变、发黏等现象。现有的nisin在酿酒酵母发酵啤酒中的应用，主要是将商业化的nisin产品，通过添加的方式，加入到发酵酿酒酵母的洗涤液中，抑制其他有害细菌的生长。但是添加方式成本较高，且商业nisin的纯度一般较低，杂质较多且含盐量高，对食品的风味有一定的影响。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提出一种酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的方法及其应用，旨在改造酵母菌使得其在啤酒酿造过程中同时合成天然的防腐剂nisin并展示至酵母细胞表面，达到在啤酒酿造中的原位生物防腐的目的。
6.为实现上述目的，本发明提出一种重组酵母工程菌的基因改造方法，所述重组酵母工程菌的基因改造方法的步骤包括：
7.将合成乳酸链球菌素前体肽的结构基因nisa或nisz插入到展示型载体质粒pyd1中，构建
①
号质粒pyd1-nisa或pyd1-nisz；
8.将合成乳酸链球菌素nisin的基因簇中的脱水酶基因nisb，环化酶基因nisc插入到载体质粒pcev-g1-km中，构建
②
号质粒pcev-g1-km-nisb-nisc；
9.将水解酶基因nisp插入到展示型载体质粒pyd1中，构建
③
号质粒pyd1-nisp；
10.将
①
号、
②
号质粒转化至第一酵母宿主菌，将
③
号质粒转化至第二酵母宿主菌。
11.本发明还提出一种重组酵母工程菌组，所述重组酵母工程菌组由如上述实施例中的重组酵母工程菌的基因改造方法得到，所述重组酵母工程菌组包括第一重组酵母菌和第二重组酵母菌，所述第一重组酵母菌可展示表达被修饰的乳酸链球菌素前体肽nisa或nisz，所述第二重组酵母菌可展示表达水解酶nisp。
12.本发明还提出一种酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的方法，所述酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的方法步骤包括：
13.s1、将合成乳酸链球菌素的前体肽结构基因nisa或nisz插入到展示型载体质粒
pyd1中，构建
①
号质粒pyd1-nisa或pyd1-nisz；
14.s2、将合成乳酸链球菌素nisin的基因簇中的脱水酶基因nisb，环化酶基因nisc插入到载体质粒pcev-g1-km中，构建
②
号质粒pcev-g1-km-nisb-nisc；
15.s3、将水解酶基因nisp插入到展示型载体质粒pyd1中，构建
③
号质粒pyd1-nisp；
16.s4、将
①
号、
②
号质粒转化至第一酵母宿主菌，将
③
号质粒转化至第二酵母宿主菌；
17.s5、将1号转化子1-eby100/(pyd1-nisa+pcev-g1-km-nisb,nisc)或1-eby100/(pyd1-nisz+pcev-g1-km-nisb,nisc)和2号转化子2-eby100/pyd1-nisp分别置于含1％-3％葡萄糖的ynb-caa培养基中培养；
18.s6、待od600为2-5，分别将1号菌样和2号菌样置换至含1％-3％半乳糖的新鲜培养基，并稀释至od600为0.5，开始诱导表达；
19.s7、诱导表达24小时后，将1号样品与2号样品混合培养。
20.在一实施例中，在步骤s4之后，步骤s5之前，还包括将第一酵母宿主菌和第二酵母宿主菌在md-trp培养板上，30℃培养箱里静置培养2-3天，筛选出1号转化子1-eby100/(pyd1-nisa+pcev-g1-km-nisb,nisc)或1-eby100/(pyd1-nisz+pcev-g1-km-nisb,nisc)和2号转化子2-eby100/pyd1-nisp。
21.在一实施例中，步骤s5的培养条件为30℃，摇床转速200rpm；步骤s7的混合培养时间为48小时。
22.本发明还提出一种重组酵母工程菌组在啤酒酿造中的应用，所述应用包括如上述实施例中的重组酵母工程菌组在啤酒酿造中的应用。
23.本发明聚焦于微生物天然防腐剂乳酸链球菌素(nisin)。nisin是一种高效，安全，无毒的天然抑菌活性多肽，已被fda批准用作多种食品的防腐剂。目前，市场上普遍通过乳酸乳球菌发酵法，提取其代谢产物nisin。但往往工艺复杂，纯度较低。另外生产成本偏高也限制了nisin的广泛应用。因此，本发明采用合成生物学的方法构建酿酒酵母菌株进行发酵，使得该酿酒酵母菌株在发酵的同时能够合成外源多肽nisin。若将构建的酿酒酵母菌株应用于啤酒酿造，则酿酒酵母在发酵啤酒的过程中同时可以合成天然的防腐剂nisin，此nisin产量足够发挥防腐剂的作用，并且纯度为100％，不需要额外添加商业化的nisin，达到减少或停止化学类防腐剂使用的目的。本发明的nisin原位生物防腐技术在啤酒等酿酒酵母发酵类饮品的应用，不仅会在很大程度上推动食品防腐剂技术的进步，为国民健康提供保障，同时也能带来巨大的经济效益。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
25.图1为酿酒酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的合成路径示意图；
26.图2为酿酒酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin一实施例所需质粒基因线路示意图；
27.图3为酿酒酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin另一实施例所需质粒基因线路示意图；
28.图4为酿酒酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素前体肽nisa或nisz的荧光图谱，放大倍数为100倍，左边为488nm激发的荧光图，右边为荧光图与白光图片合并之后的显示图片；
29.图5为酿酒酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的抑菌实验结果：
30.c1-pbs+0.05％乙酸+0.5mg/mltrypsin；
31.c2-eby100(阴性对照)；
32.1和3-nisin(c端融合6
×
his-tag)；
33.2和4-nisin(n端融合6
×
his-tag)；
34.1和2号样品中的两种修饰酶基因nisb和nisc的启动子为持续型启动子，3和4号样品中的两种修饰酶基因nisb和nisc的启动子为诱导型启动子；
35.nisin标准样品的浓度为1mg/ml，1mg＝1000iu；
36.以上所有样品的上样量均为50μl。
37.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后
……
)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
40.另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，若全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案，或b方案，或a和b同时满足的方案。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
41.本发明提出一种重组酵母工程菌的基因改造方法，所述重组酵母工程菌的基因改造方法的步骤包括：
42.将合成乳酸链球菌素的前体肽结构基因nisa或nisz插入到展示型载体质粒pyd1中，构建
①
号质粒pyd1-nisa或pyd1-nisz；
43.将合成乳酸链球菌素nisin的基因簇中的脱水酶基因nisb，环化酶基因nisc插入到载体质粒pcev-g1-km中，构建
②
号质粒pcev-g1-km-nisb-nisc；
44.将水解酶基因nisp插入到展示型载体质粒pyd1中，构建
③
号质粒pyd1-nisp；
45.将
①
号、
②
号质粒转化至第一酵母宿主菌，将
③
号质粒转化至第二酵母宿主菌。
46.乳酸链球菌素又称乳球菌肽或乳链菌肽，英文名为nisin，是由乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactissubsp.lactis)在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小分子肽，是一种天然食品防腐剂。它对绝大多数食物腐败菌和病原菌在内的革兰氏阳性菌尤其是芽孢杆菌具有强烈的抑制作用，而对革兰氏阴性菌、酵母和霉菌无抑制作用。另外，nisin与edta共同作用可抑制沙门氏菌和其他革兰氏阴性菌的生长。nisin对热稳定，具有耐酸性，食用后在消化道内很快被α-胰凝乳蛋白酶有效降解，不会产生抗性和过敏反应，对人体无任何的毒副作用。早在1988年，nisin就被美国食品与药物管理局(fda)批准在食品中使用。目前已被60多个国家批准作为一种无毒的天然食品防腐剂，广泛应用于乳制品、肉制品、罐头制品、果汁和酒精饮料等多种食品的防腐保鲜。
47.目前，nisin的工业生产是采用nisin产生菌乳酸乳球菌亚种，以巴氏灭菌奶添加酵母膏经蛋白酶处理后为培养基，在ph值6.0和温度30℃条件下进行发酵、提取和加工而得。虽然nisin是一种高效的食品防腐剂，通常皮摩尔到纳摩尔数量级的nisin即可发挥其抑菌作用。但目前市场上销售的都是纯度较低的乳酸链球菌素盐制剂，杂质较多且含盐量高，对食品的风味有一定的影响。
48.另一方面，酵母是安全的食品原料，在中国，酵母被广泛用来制作馒头、酿制白酒，其应用也已经有几千年的历史。目前全球酵母的产量超过100万吨，系人类年利用量唯一超过百万吨的微生物。酵母容易在实验室操作和培养；另外有一些酵母已经被开发为异源蛋白表达系统使用，利用基因技术可使酵母细胞展示表达外源蛋白质。
49.根据文献报道，合成活性乳酸链球菌素(nisin)的基因是由11种基因组成的一个基因簇，它们按转录顺序依次排列为nisabtcip，nisrk，和nisfeg。其中，nisa或nisz是合成nisina或nisinz的结构基因；nisb、nisc，nist，和nisp分别代表nisin的翻译后修饰基因，合成脱水酶nisb和环化酶nisc，转运酶nist和水解酶nisp；nisr，nisk则是是参与调控nisin基因簇表达的基因；nisi，nisfeg是对乳酸乳球菌发挥免疫作用的基因。nisin的生物合成路径为，nisa或nisz结构基因表达的链状多肽nisa或nisz，被脱水酶nisb作用脱去8分子的水，随后在环化酶nisc的作用下分子内生成的碳碳双键与邻近半胱氨酸上的巯基发生加成反应，生成带有硫醚键的分子内环状结构。最后在水解酶nisp的作用下，切除前导肽(leader peptide)，释放出包含34个氨基酸的生物活性nisin。要实现在外源微生物表达具有生物活性的nisin，在目标基因上游插入强启动子后，至少还需要基因簇中nisa或nisz、nisb、nisc、nisp四种基因。
50.本发明技术通过对酵母细胞的基因进行改造，以使酵母细胞表达出活性乳酸链球菌素nisin。酵母细胞可以是酿酒酵母细胞，也可以是其他酵母细胞如啤酒酵母细胞、毕赤酵母细胞、面包酵母细胞等，可根据实际需要进行选择，在此不做过多限定。
51.在本发明一实施例中，采用酿酒酵母表面展示表达系统，将表达的乳酸链球菌素nisin分泌到酿酒酵母细胞外。以上表达系统需构建酿酒酵母展示型质粒pyd1，此质粒包含α-凝集素gpi锚定展示表达系统。α-凝集素的分泌蛋白aga通过两对二硫键与核心蛋白aga1p连接，将目标多肽nisin与结合亚基aga2p的c末端融合，aga2p融合蛋白和aga1p在分泌途径中结合，并被转运到细胞表面后与细胞壁共价结合。本实施例将表达链状多肽nisa或nisz的结构基因nisa或nisz整合至α-凝集素的分泌蛋白aga2p的c端，得到第一种展示表达质粒pyd1-nisa或pyd1-nisz。将nisb，nisc两种基因整合至另一种载体质粒pcev-g1-km，
得到表达脱水酶nisb和环化酶nisc的第二种表达载体质粒pcev-g1-km-nisb-nisc。将以上构建的两种表达载体质粒同时转化入酿酒酵母细胞，诱导两种表达载体质粒同时表达目标基因，得到展示到酵母细胞表面的被蛋白酶nisb，nisc修饰的乳酸链球菌素前体肽nisa或nisz。构建第三种表达载体质粒pyd1-nisp，目的是将水解酶nisp展示表达到另一种酿酒酵母细胞壁上，与第一种酿酒酵母细胞展示的乳酸链球菌素前体肽nisa或nisz相互作用，切除其前导肽(leader peptide)，即可得到生物活性的nisin。展示表达活性乳酸链球菌素nisin的合成路径示意图如图1；其中涉及到的质粒中基因路线图如图2和图3所示。
52.本发明还提出一种重组酵母工程菌组，所述重组酵母工程菌组由如上述实施例中的重组酵母工程菌的基因改造方法得到，所述重组酵母工程菌组包括第一重组酵母菌和第二重组酵母菌，所述第一重组酵母菌可展示表达被修饰的乳酸链球菌素前体肽nisa或nisz，所述第二重组酵母菌可展示表达水解酶nisp。
53.本发明还提出一种酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的方法，所述酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素nisin的方法步骤包括：
54.s1、将合成乳酸链球菌素的前体肽结构基因nisa或nisz插入到展示型载体质粒pyd1中，构建
①
号质粒pyd1-nisa或pyd1-nisz；
55.s2、将合成乳酸链球菌素nisin的基因簇中的脱水酶基因nisb，环化酶基因nisc插入到载体质粒pcev-g1-km中，构建
②
号质粒pcev-g1-km-nisb-nisc；
56.s3、将水解酶基因nisp插入到展示型载体质粒pyd1中，构建
③
号质粒pyd1-nisp；
57.s4、将
①
号、
②
号质粒转化至第一酵母宿主菌，将
③
号质粒转化至第二酵母宿主菌；
58.s5、将1号转化子1-eby100/(pyd1-nisa+pcev-g1-km-nisb,nisc)或1-eby100/(pyd1-nisz+pcev-g1-km-nisb,nisc)和2号转化子2-eby100/pyd1-nisp分别置于含1％-3％葡萄糖的ynb-caa培养基中培养；
59.s6、待od600为2-5，分别将1号菌样和2号菌样置换至含1％-3％半乳糖的新鲜培养基，并稀释至od600为0.5，开始诱导表达；
60.s7、诱导表达24小时后，将1号样品与2号样品混合培养。
61.在一实施例中，在步骤s4之后，步骤s5之前，还包括将第一酵母宿主菌和第二酵母宿主菌在md-trp培养板上，30℃培养箱里静置培养2-3天，筛选出1号转化子1-eby100/(pyd1-nisa+pcev-g1-km-nisb,nisc)或1-eby100/(pyd1-nisz+pcev-g1-km-nisb,nisc)和2号转化子2-eby100/pyd1-nisp。
62.在一实施例中，步骤s5的培养条件为30℃，摇床转速200rpm；步骤s7的混合培养时间为48小时。
63.下面通过具体实验来说明经过基因改造后的重组酵母工程菌展示表达出了活性乳酸链球菌素nisin。实验条件和过程如下：
64.1.菌种和生长条件
65.野生型酿酒酵母eby100菌株来自于本实验室。大肠杆菌top10菌株用于质粒构建和增殖。在所有实验中，大肠杆菌生长培养基均使用含有100mg/l氨苄青霉素的lb培养基。野生型酿酒酵母eby100的培养使用ypd培养基，转化了载体质粒的酿酒酵母工程菌使用yna-caa培养基，按需求加入抗生素g418，终浓度为200mg/l。所有琼脂培养基含agar的浓度
为1.5％。其中，用于酿酒酵母转化子扩大培养和诱导目标基因表达时的培养基中添加的葡萄糖，棉子糖或半乳糖的浓度均为20g/l。所有大肠杆菌的培养条件均为37℃，摇床转速200rpm；所有酿酒酵母的培养条件均为30℃，摇床转速200rpm。
66.2.质粒的构建
67.将控制表达乳酸链球菌素nisin的结构基因nisa或nisz通过吉布森組裝gibson assembly的方法，插入到载体质粒pyd1的gslinker基因的下游，构建展示表达乳酸链球菌素前体肽nisa或nisz的质粒
①
pyd1-nisa或pyd1-nisz；脱氢酶基因nisb和环化酶基因nisc通过吉布森組裝gibson assembly的方法，分别插入到载体质粒pcev-g1-km的第一个和第二个基因表达盒子中，得到表达修饰酶的质粒
②
pcev-g1-km-nisb-nisc；将表达水解酶nisp的基因，通过吉布森組裝gibson assembly的方法插入到载体质粒pyd1的gs linker基因的下游，得到展示表达水解酶nisp的质粒
③
pyd1-nisp。将gibson assembly产物化学转化入大肠杆菌top10感受态，在含有100mg/l氨苄青霉素的lb琼脂培养基上培养，筛选出阳性单克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将得到的测序结果正确的表达载体质粒，用质粒提取试剂盒(omega,质粒小量提取试剂盒i型)，提取构建正确的
①
号、
②
号和
③
号质粒。将构建好的质粒，用liac/ssdna/peg转化法，转化至自制的酿酒酵母宿主菌eby100感受态细胞，在md-trp培养板上，30℃培养箱里静置培养2-3天，筛选出1号转化子1-eby100/(pyd1-nisa+pcev-g1-km-nisb,nisc)或1-eby100/(pyd1-nisz+pcev-g1-km-nisb,nisc)和2号转化子2-eby100/pyd1-nisp。
68.3.诱导酿酒酵母工程菌展示表达nisin
69.将1号转化子1-eby100/(pyd1-nisa+pcev-g1-km-nisb,nisc)或1-eby100/(pyd1-nisz+pcev-g1-km-nisb,nisc)和2号转化子2-eby100/pyd1-nisp分别置于10ml含2％葡萄糖的ynb-caa培养基中培养，培养条件为30℃，摇床转速200rpm，其中，1号样加200μg/ml的抗生素g418。待培养菌液在600nm波长处的吸光值od600为2-5时，收集菌体，置换至含2％半乳糖的新鲜培养基，并稀释至od600为0.5，开始诱导表达。诱导时间为24小时后，将5ml的1号样品，与5ml的2号样品混合培养。(即1-eby100/(pyd1-nisa+pcev-g1-km-nisb,nisc),或1-eby100/(pyd1-nisz+pcev-g1-km-nisb,nisc)与2-eby100/pyd1-nisp混合培养)。混合培养时间为48小时；或者将1号菌样诱导培养48小时后，收集菌体，用胰蛋白酶trypsin代替nisp水解酶切除乳酸链球菌素前体肽nisa或nisz上的前导序列，释放出生物活性nisin。
70.4.荧光显微镜实验验证目标产物的展示表达量
71.酿酒酵母工程菌展示表达的乳酸链球菌素前体肽nisa或nisz的n端融合了6
×
his蛋白标签，分别用anti-his tag mouse一抗，以及fitc-conjugated goat anti-mouse igg二抗识6
×
his蛋白标签。然后在激发光波长为488nm，放大倍数为100倍的条件下，拍摄展示到酿酒酵母表面的目标多肽的荧光图谱。如图4所示。从图中可见大部分酿酒酵母细胞表面都展示表达了目标肽nisa或nisz。
72.5.抑菌活性实验验证酿酒酵母表达nisin的抑菌活性
73.收集表达48小时后的1号酿酒酵母细胞4ml，pbs缓冲液洗一次，加入50μl pbs，5μl 0.05％乙酸和10μl 4mg/ml胰蛋白酶trypsin,37℃下静置2小时。12000rpm离心5min后取上清液，待做抑菌实验。
74.以乳酸链球菌(l.lactis subsp.cremoris strain hp)为敏感菌做抑菌实验：配
制m17/agar培养基，其中，取7.45gm17样品粉末，3g琼脂，用200ml去离子水重悬，121℃灭菌15min，冷却至50℃左右时，加入终浓度为0.5％的无菌葡萄糖充分混匀。取出其中的20ml，待培养基温度降至40℃左右时，按照250:1的体积比，加入od600＝0.5的乳酸链球菌培养液，充分混匀，倒入直径约9cm的细菌培养板，室温下在无菌操作箱中吹干约20min。用打孔器在凝固的琼脂培养板上打孔，加入制备好的nisin抗菌溶液对照组和样品组，30℃培养箱静置培养24小时后，相机拍照记录抑菌实验结果，如图5，抑菌实验结果显示，酿酒酵母工程菌成功表达了具有抑菌活性的nisin。该菌株可应用于啤酒发酵，则在发酵啤酒的同时，产生的抗菌肽nisin可以抑制其他革兰氏阳性啤酒腐败菌的生长，简化了防腐步骤，降低了啤酒酿造过程中需要单独加入商业化防腐剂nisin所带来的成本。
75.本发明还提出一种重组酵母工程菌组在啤酒酿造中的应用，所述应用包括如上述实施例中的重组酵母工程菌组在啤酒酿造中的应用。
76.本发明一实施例采用合成生物学的方法构建酿酒酵母菌株进行发酵，使得该酿酒酵母菌株在发酵的同时能够合成外源多肽nisin。将构建的酿酒酵母菌株应用于啤酒酿造，则酿酒酵母在发酵啤酒等产品的过程中同时可以合成天然的防腐剂nisin的前体肽nisa或nisz以及水解酶nisp，并将其展示至酵母细胞表面，水解酶nisp与被修饰的前体肽nisa或nisz相互作用，切除nisin前体肽的前导序列，即可得到生物活性的nisin，在发酵啤酒等产品的过程中发挥其防腐作用。此nisin产量足够发挥防腐剂的作用，并且纯度为100％，不需要额外添加商业化的nisin，达到减少或停止化学类防腐剂使用的目的。本发明的nisin原位生物防腐技术在啤酒等酿酒酵母发酵类饮品的应用，不仅会在很大程度上推动食品防腐剂技术的进步，为国民健康提供保障，同时也能带来巨大的经济效益。
77.以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。