抗PIC的抗体、试剂盒及检测PIC的方法与流程

本发明涉及血液检测领域，具体而言，涉及一种抗pic的抗体、试剂盒及检测pic的方法。

背景技术：

1、血液凝固过程中形成的纤维蛋白，被分解液化的过程，叫纤维蛋白溶解(简称纤溶)。纤溶是体内重要的抗凝血过程。它和血凝过程一样，也是机体的一种保护性生理反应。纤溶系统的主要功能是清除沉积在血管壁上的纤维蛋白，溶解凝血块而保持血流通畅。其中纤溶酶(plasmin)和α2-纤溶酶抑制剂(α2-ap)对机体的血栓形成和溶解起着重要作用。

2、纤溶酶由纤溶酶原(plg)受纤溶酶原激活物作用后转化而来，与纤溶酶原有相似的抗原性，属丝氨酸蛋白酶，可降解交叉联结的纤维蛋白原或血纤蛋白形成纤维蛋白降解产物，有利于血栓的降解。α2-纤溶酶抑制剂是血浆中最重要的一种纤溶酶特异性抑制物，可与纤溶酶反应形成共价酶抑制剂，使纤溶酶失活，从而控制纤溶系统的激活程度，调节凝血和纤溶系统平衡，用于抑制血纤蛋白的过度水解，避免过度失血。

3、纤溶酶在血液中的半衰期极短(约10min)，难以直接测定，α2纤溶酶抑制剂可迅速地中和纤溶酶，以致血浆中无法检测到活性纤溶酶。纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物(pic)是纤溶酶与α2纤溶酶抑制剂(α2-ap)以1：1的比例形成的复合物，即机体纤溶与抗纤溶物质相互结合的产物，是检测纤溶系统激活的标志物，有助于全面了解机体的凝血、纤溶状态。pic在血液中半衰期较长，约为6小时。

4、正常血浆中前体分子纤溶酶原和α2-ap的浓度约为pic的100倍以上，为避免这些前体分子的干扰，抗体的特异性对pic的测定显得尤为重要。现有技术中已有的检测pic的抗体及检测方法，如monoclonal antibodies to discrete regions in a2-plasmininhibitor所公开的检测方法：通过固相载体连接抗纤溶酶原抗体，过氧化酶标记抗α2纤溶酶抗体，分两步检测。

5、上述检测方法中，采用现有配对方案plasmin抗体和anti-α2plasmin抗体进行检测的，检出效果不佳：纤溶酶原血液浓度约为0.2mg/ml，α2纤溶酶抑制剂约为0.07mg/ml，约为pic的100倍以上。纤溶酶与纤溶酶原具有相似的抗原性，采用plasmin抗体作为捕获抗体捕获待测物pic时，会受到血浆中大量存在的纤溶酶原的干扰，造成检测灵敏度降低。同时，纤溶酶原浓度在不同个体之间存在一定范围的波动，plasmin抗体方案检测不同个体pic水平时易产生波动，抗干扰性差。同样地，采用anti-α2plasmin抗体作为检测抗体，也会受到血液中大量存在的α2纤溶酶抑制剂的干扰，为降低α2-ap的干扰，必须分步检测，在plasmin抗体与样本温育反应后，洗去样本中的α2-ap，再加入标记了发光物质的anti-α2plasmin抗体，完成检测。因此上述技术方案，除了会受到样本自身高浓度前体物质的干扰，降低检测灵敏度和准确性，还必须采用分步法，反应时间长。

6、另外，现有技术中尽管也有专利文件公开了采用复合物抗体进行检测的，但至今尚未发现有相关市售产品。因此，仍需要开发新的能够特异性检测pic的相关检测产品

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种抗pic的抗体、试剂盒及检测pic的方法，以提供一种特异性高的pic检测产品。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗pic的抗体，该抗pic的抗体包括6个cdr，6个cdr选自(i)或(ii)：其中(i)cdr1-vl1，具有seq id no：1所示序列：rasesvdsfgysfx1h，其中x1是m或l；cdr2-vl1，具有seq id no：2所示序列：rasnles；cdr3-vl1，具有seq id no：3所示序列：qqtnedpx2t，其中x2是y或f或w；cdr1-vh1，具有seq id no：4所示序列：sswmn；cdr2-vh1，具有seq id no：5所示序列：riypgdgx3tnyngkfkg，其中x3是d或h；和cdr3-vh1，具有seq id no：6所示序列：g x4pttayamdy，其中x4是n、s或r；或者(ii)cdr1-vl2，具有seq id no：7所示序列：kasqdikx5fln，其中x5为s或n；cdr2-vl2，具有seq idno：8所示序列：yax6slad，其中x6为r或t；cdr3-vl2，具有seq id no：9所示序列：lqhgespft；cdr1-vh2，具有seq id no：10所示序列：sx7wmh，其中x7为s或y；cdr2-vh2，具有seq id no：11所示序列：x8idpydsethynqkfkd，其中x8为y或r或n；和cdr3-vh2，具有seq id no：12所示序列：gydrsfdx9，其中x9为y或f。

3、进一步地，抗pic的抗体选自如下野生型或如下任一种突变组合：

4、

5、

6、进一步地，抗pic的抗体选自如下野生型或如下任一种突变组合：

7、

8、

9、进一步地，抗pic的抗体还包括轻链可变区的骨架区和重链可变区的骨架区，其中，轻链可变区的骨架区包括fr1-vl1、fr2-vl1、fr3-vl1和fr4-vl1，重链可变区的骨架区包括fr1-vh1、fr2-vh1、fr3-vh1和fr4-vh1，或者，轻链可变区的骨架区包括fr1-vl2、fr2-vl2、fr3-vl2和fr4-vl2，重链可变区的骨架区包括fr1-vh2、fr2-vh2、fr3-vh2和fr4-vh2，其中，fr1-vl1具有seq id no：13：的氨基酸序列或者与seq id no:13具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr2-vl1具有seq id no：14的氨基酸序列或者与seq id no:14具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr3-vl1具有seq id no：15的氨基酸序列或者与seq id no:15具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr4-vl1具有seq id no：16的氨基酸序列或者与seq id no:16具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr1-vh1具有seq id no：17的氨基酸序列或者与seq id no:17具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr2-vh1具有seq id no：18的氨基酸序列或者与seq id no:18具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr3-vh1具有seq id no：19的氨基酸序列或者与seq id no:19具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr4-vh1具有seq id no：20的氨基酸序列或者与seq id no:20具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr1-vl2具有seq id no：21：的氨基酸序列或者与seq id no:21具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr2-vl2具有seq id no：22的氨基酸序列或者与seq id no:22具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr3-vl2具有seq id no：23的氨基酸序列或者与seq id no:23具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr4-vl2具有seq id no：24的氨基酸序列或者与seq id no:24具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr1-vh2具有seq id no：25的氨基酸序列或者与seq id no:25具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr2-vh2具有seq id no：26的氨基酸序列或者与seq id no:26具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr3-vh2具有seq id no：27的氨基酸序列或者与seq id no:27具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；fr4-vh2具有seq id no：28的氨基酸序列或者与seq id no:28具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；seq id no：13：divltqspaslavslgqratlsc；seqid no：14：wyqqnpgqppklliy；seq id no：15：giparfsgsgsrtdftltinpveaddvatyfc；seq idno：16：fgggakleik；seq id no：17：qvqlqqsgpelvkpgasvklsckasgnafs；seq id no：18：wvkqrpgqglewig；seq id no：19：katltvdkssstvymqlssltsvdsavyfcgr；seq id no：20：wgqgtsvtvss；seq id no：21：dikmtqspssmfaslgervtitc；seq id no：22：wyqqkpwrspktliy；seq id no：23：gvpsrfsgsgsgqdfsltisslesddaatyyc；seq id no：24：fgggtkleik；seq id no：25：qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgytft；seq id no：26：wvkqrpeqglewig；seq id no：27：kailtvdkssstaymqlssltsedsavyycar；seq id no：28：wgqgttltvss。

10、进一步地，抗pic的抗体具有如下任意一种轻链可变区和重链可变区：(i)seq idno：29所示的轻链可变区vl1和seq id no：30所示的重链可变区vh1；seq id no：29：divltqspaslavslgqratlscrasesvdsfgysfmhwyqqnpgqppklliyrasnlesgiparfsgsgsrtdftltinpveaddvatyfcqqtnedpytfgggakleik；seq id no：30：qvqlqqsgpelvkpgasvklsckasgnafssswmnwvkqrpgqglewigriypgdgdtnyngkfkgkatltvdkssstvymqlssltsvdsavyfcgrgnpttayamdywgqgtsvtvss；(ii)seq id no：31所示的轻链可变区vl2和seq id no：32所示的重链可变区vh2；seq id no：31：

11、dikmtqspssmfaslgervtitckasqdiksflnwyqqkpwrspktliyyatsladgvpsrfsgsgsgqdfsltisslesddaatyyclqhgespftfgggtkleik；seq id no：32：qvqlqqpgaelvrpgasvklsckasgytftsswmhwvkqrpeqglewigyidpydsethynqkfkdkailtvdkssstaymqlssltsedsavyycargydrsfdywgqgttltvss；(iii)与seq id no：29所示序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的轻链可变区和与seq id no：30所示序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的重链可变区；(iv)与seq id no：31所示序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的轻链可变区和与seq id no：32所示序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的重链可变区。

12、进一步地，抗体为全长抗体，全长抗体还包括轻链恒定区cl和重链恒定区ch，其中，轻链恒定区cl的序列为：1)seq id no：33；2)与seq id no：33所示序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；重链恒定区ch的序列为：1)seq id no：34；2)与seq id no：34所示序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。

13、进一步地，抗pic的抗体与pic具有4.30*10-11≤kd(m)≤7.58*10-9的亲和力；优选地，抗pic的抗体是人的、人源化的或是嵌合的。

14、根据本技术的第二个方面，提供了一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码上述任一种抗pic的抗体。

15、根据本技术的第三个方面，提供了一种表达载体，表达载体包括上述分离的核酸分子。

16、根据本技术的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转染有上述表达载体。

17、根据本技术的第五个方面，提供了一种pic检测试剂盒，该试剂盒包括上述任一种抗pic的抗体。

18、进一步地，试剂盒包括两种抗pic的抗体，其中一种为包被于磁球上的抗pic的抗体，一种是标记的抗pic的抗体；优选地，标记的抗pic的抗体为abei标记的抗pic抗体；优选地，试剂盒还包括校准品和/或质控品。

19、根据本技术的第五个方面，提供了一种检测pic的方法，该方法包括：按照一步法双抗体夹心法使来自受试者的样品与上述任一种抗pic的抗体接触以进行结合反应；检测结合反应是否产生免疫复合物，若产生免疫复合物，则表明pic存在。

20、进一步地，该方法选自如下任意一种或多种：荧光免疫法、化学发光免疫法、胶体金免疫法、放射免疫法或酶联免疫法；优选地，化学发光免疫法为化学发光免疫双抗体夹心法；优选地，方法采用半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪进行分析。

21、进一步地，样品选自全血、血清或血浆中的至少一种，优选地，全血、血清或血浆来源于外周血。

22、应用本发明的技术方案，含有本技术cdrs的抗pic的抗体对pic具有更高亲和力和特异性，因而本技术提供的抗pic的抗体组合应用于双抗体夹心法检测pic时，能够通过一步法检测获得待测样本中是否含有pic，在检测特异性和准确性较高的前提下，还能够大大提高检测速度和效率。