一种短小芽孢杆菌TS1及其应用

一种短小芽孢杆菌ts1及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种短小芽孢杆菌ts1及其应用。


背景技术：

2.应激或应激反应是指机体在受到各种强烈因素(应激源)刺激时所出现的非特异性全身反应。应激源是指向机体提出适应要求，并可引起应对反应、稳态失衡的客观变化的环境事件或情境，也可称为刺激物或刺激。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内产生了过多的高活性分子，如活性氧、活性氮，而此时细胞对氧化物的清除能力已远远不能满足对抗现有的氧化程度所应该提供的抗氧化能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，这种失衡会导致细胞以及重要的生物分子受损，对整个生物体都有潜在的影响。在家禽养殖领域中，家禽遭到应激源的刺激后，免疫力和抵抗力会降低，最终导致家禽采食量减少，生长发育减缓或停滞，免疫力降低，甚至引起死亡，给养殖业造成巨大经济损失。
3.集约化养殖在家禽养殖中的大规模应用，在取得良好的经济效益的同时，各种应激源对家禽生长的刺激问题也日益凸显。如：拥挤的养殖环境，对家禽的捕捉、驱赶，导致其惊群；热、冷等温度刺激以及各种病原微生物感染等因素均可以成为应激源。许多研究表明，家禽在遭受多种应激源的刺激下，会导致家禽组织脏器或血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等活性下降和活性氧(ros)、no、丙二醛(mda)的上升，从而造成氧化应激损伤。
4.家禽养殖过程中的应激不可避免，因此找到一种可以缓解应激带来损伤的方法意义重大。由于应激是对动物机体的非特异性损伤，因此没有针对性的药物。我们可以通过在饲料中添加合适的短小芽孢杆菌，减轻家禽氧化应激引起的组织和脏器损伤。因此，寻找到一种适用于加入饲料中的短小芽孢杆菌，减轻家禽氧化应激引起的组织和脏器损伤有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种短小芽孢杆菌，加入家禽的饲料中，减轻家禽氧化应激引起的组织和脏器损伤。
6.第一方面，本技术提供的一种短小芽孢杆菌，名称为短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)ts1，所述短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)ts1保藏号为cctcc no.m2022538。
7.芽孢杆菌属(bacillus)，细菌的一属，能形成芽孢(内生孢子)。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌属细菌较大(4-10μm)，革兰氏阳性、是严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。
8.短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)是菌体细杆状的芽孢杆菌属的一种细菌，一般为0.6-0.7μm
×
2.0-3.0μm，革兰氏阳性。短小芽孢杆菌常被用作防治小麦根腐病和草莓灰霉病。
9.可选的，所述短小芽孢杆菌ts1的16s rdna序列为：seq id no：1，所述短小芽孢杆菌ts1耐酸耐胆盐，有抑菌效果。
10.短小芽孢杆菌的优势具体表现为：(1)易保存、抗逆性好：分离、培养和保藏的条件简单，对工业化工生产技术要求低，能够在肠胃中保持稳定作用并且保持较高活性；其自身产生的芽孢对外在的恶劣环境(如热、紫外线、电离辐射和低ph(2-3)等)能产生抵抗作用；(2)在家禽的生产养殖过程中，可以促进家禽的生长发育、增进畜禽生长性能，对营养要求简单，能够迅速促进新陈代谢；(3)还可以减轻家禽氧化应激或者致病菌感染所引起的组织脏器的损伤。短小芽孢杆菌具有易保存，活性成分高等优势，值得被大量推广和应用。
11.可选的，所述短小芽孢杆菌ts1是从牦牛粪中分离的。
12.第二方面，本技术提供了一种短小芽孢杆菌ts1在制备饲料添加剂中的应用。
13.家禽行业主要通过饲料添加剂来调控肠道菌群，从而改善肠道健康。虽然取得一定进展，但考虑到添加剂的类别，家禽种类，饲养环境等问题，实际生产效果不尽相同。短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)作为饲料添加剂的一种，在动物生产中较之其他饲料添加剂具有其独特的优势，也因此被广泛应用。
14.可选的，所述饲料添加剂的剂型为冻干粉剂。
15.冻干粉是采用冷冻干燥机的真空冷冻干燥法预先将药液里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将药液里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥而成。
16.可选的，所述冻干粉剂中的短小芽孢杆菌ts1含量≥109cfu/g。
17.可选的，所述冻干粉剂的使用量达到1g/只/天。
18.第三方面，本技术提供了一种短小芽孢杆菌ts1在制备缓解应激造成的损伤的饲料添加剂中的应用。
19.应急反应是家禽家畜在受到应激源的刺激后，引起敏感机体的过敏反应。如拥挤的养殖环境，对家禽的捕捉、驱赶，导致其惊群；热、冷等温度刺激以及各种病原微生物感染等因素均可以成为应激源。
20.氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内产生了过多的高活性分子，如活性氧、活性氮，而此时细胞对氧化物的清除能力已远远不能满足对抗现有的氧化程度所应该提供的抗氧化能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，这种失衡会导致细胞以及重要的生物分子受损，对整个生物体都有潜在的影响。目前许多研究表明，家禽在遭受多种应激源的刺激下，都会导致家禽组织脏器或血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等活性下降和活性氧(ros)、no、丙二醛(mda)的上升，从而造成氧化应激损伤，最终导致家禽采食量减少，生长发育减缓或停滞，免疫力降低，甚至引起死亡，给养殖业造成巨大经济损失。
21.由于应激是对动物机体的非特异性损伤，因此没有针对性的药物，可以通过添加合适的饲料添加剂提高家禽机体健康，增强免疫力，或者改善饲养环境等方式来减轻应激损伤。其中ts1属于短小芽孢杆菌，属于饲料添加剂允许添加的微生物。
附图说明
22.为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为16s rdna序列在ncbi上blast的结果；
24.图2为短小芽孢杆菌ts1的pcr产物琼脂糖电泳图；
25.图3为短小芽孢杆菌ts1在ph＝7.12、6.04、5.03、4.06和3.02的lb培养液中培养24小时的存活率结果(其中，横坐标为lb培养液的ph值，纵坐标为短小芽孢杆菌ts1的存活率)；
26.图4为短小芽孢杆菌ts1在胆盐浓度为0.05％、0.1％、0.2％和0.3％的lb培养液中培养24小时的存活率结果(其中，横坐标为lb培养液的胆盐浓度，纵坐标为短小芽孢杆菌ts1的存活率)；
27.图5为短小芽孢杆菌ts1对革兰氏阴性菌的抑菌圈(其中，左侧图片是大肠杆菌，右侧图片是沙门氏菌)；
28.图6为短小芽孢杆菌ts1对革兰氏阳性菌的抑菌圈(其中，左侧图片是链球菌，右侧图片是金黄色葡萄球菌)；
29.图7为短小芽孢杆菌ts1对鸡体重的影响结果(其中，横坐标为喂养的天数，纵坐标为鸡的体重；柱状图中深颜色的为对照组，浅颜色的为实验组；*表示p《0.05)。
具体实施方式
30.下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本技术相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本技术的一些方面相一致的系统和方法的示例。
31.实施例1：短小芽孢杆菌ts1的分离纯化
32.用镊子夹取小块来自甘肃山丹军马场的健康牦牛粪样品至装有5ml蒸馏水的玻璃试管中，用封口膜封住管口于沸水中煮沸10分钟；取煮沸后的上清液100μl至装有5ml lb液体培养基的ep管中，放入摇床37℃、160-180rpm摇菌16-18h；取摇好的菌液100μl加入5ml液体培养基中再次摇菌16h。
33.蘸取摇好的菌液在lb平板中划线，于37℃恒温箱中倒置培养12-18h，挑取单菌落接平板于37℃恒温箱培养12-18h进行纯化，再次挑取单菌落至5ml lb液体培养基中摇菌16-18h得到菌液，与等体积lb冻存液混合于-80℃冷冻保存。
34.实施例2：短小芽孢杆菌ts1的鉴定
35.用16s通用引物进行测序确定分离出的益生菌的序列，16s测序结果如seq id no:1所示。测得的16s rdna序列采用blast软件与数据库比较分析。16s rdna序列在ncbi上blast的结果如图1所示，与短小芽孢杆菌有99％以上的同源性。
36.pcr扩增反应时，将新鲜的菌液、16s通用引物还有pcr酶按在pcr管中，按照25μl的2xtaq plus master mix，2μl的引物27f和2μl的引物1492r，1-5μl的新鲜菌液以及二次蒸馏水共50μl。pcr的扩增条件为：95℃预变性3min；在95℃变性15s，50.6℃退火15s，72℃延伸100s，循环30-35次；最终72℃延伸5min。
37.将pcr产物加入到1％琼脂糖核酸胶中在1xtae电泳液中进行电泳，结束后照胶即可获得16s结果。结果如图2所示，在1670bp左右出现目标条带，阴性对照无条带。
38.实施例3：耐酸试验
39.配制酸性培养基：在500ml lb液体培养基中加入36.0％-38.0％盐酸溶液6.4ml，室温下调溶液ph＝7.0、6.0、5.0、4.0和3.0左右。
40.摇菌：以1％接种量取50μl活化后的菌液，分别加入4950μl ph＝7.0、6.0、5.0、4.0和3.0左右的lb酸性液体培养基中，再取50μl活化后的菌液加入4950μl正常lb液体培养基中作为对照，并同时放入温度为37℃、转速为160-180rpm摇床摇菌16-18h。
41.测量吸光值：在摇菌0h、24h分别测酸性培养基和正常培养基培养的菌液在600nm下的吸光值(od600)。
42.计算存活率：根据比尔-朗伯定律a＝kbc(a：吸光度；k：摩尔吸光系数；b：吸光层厚度；c：浓度)，细菌在600nm波长处有最大吸光值，细菌浓度c＝a/kb，与吸光值成正比。
43.存活率＝x1/x0×
100％(x1：酸性培养基中培养24h的活菌数；x0：酸性基培养中培养0h的活菌数)；用细菌浓度表示活菌数，最终存活率可表示为：存活率＝a1/a0×
100％(a1：酸性培养基中培养24h的吸光值；a0：酸性培养基中培养0h的吸光值)
44.实耐酸验中，配置的lb培养液的ph值具体为7.12、6.04、5.03、4.06和3.02，存活率如图3所示，短小芽孢杆菌ts1具有良好的耐酸特性，其中在ph＝7.12的时候，短小芽孢杆菌ts1的存活率在五组中，是最高的。
45.实施例4：耐碱试验
46.配制胆盐培养基：向500ml lb液体培养基中中加入1.5g牛胆盐使其含量为0.3％，再梯度稀释为0.2％、0.1％、0.05％。
47.摇菌：以1％接种量取50μl活化后的菌液，分别加入4950μl不同胆盐浓度培养液中，再取50μl活化后的菌液加入4950μl正常lb液体培养基中作为对照，并同时放入温度为37℃、转速为160-180rpm摇床摇菌16-18h。
48.测量吸光值：在摇菌0h、24h分别测不同浓度胆盐培养液中培养菌液的od600值；
49.计算存活率：存活率＝b1/b0×
100％(b1：胆盐培养基中培养24h的吸光值；b0：胆盐培养基中培养0h的吸光值)
50.本耐碱试验的结果如图4所示，短小芽孢杆菌ts1的具有良好的耐酸性能。在胆盐浓度为0.05％、0.1％、0.2％和0.3％的lb培养液中的24h存活率都高于60％，在胆盐浓度为0.05％的lb培养液中存活率超过了90％，并且随着浓度的升高，存活率降低。
51.实施例5：短小芽孢杆菌ts1对革兰氏阴性菌的体外抑菌试验
52.致病菌的培养：大肠杆菌和沙门氏菌的培养同ts1复苏、活化过程类似，最终与ts1同步进行摇菌得到活化菌液；
53.致病菌稀释：取五个10ml离心管，每管加入4.5ml无菌pbs，取500μl菌液加入第一个管中混匀，再取第一管中500μl稀释菌液，加入第二管中混匀
……
依次类推进行梯度稀释，得到浓度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
的致病菌菌液。
54.铺板子：将lb营养琼脂平板在超净台酒精灯等旁吹5-10分钟后，将稀释好的大肠杆菌和沙门氏菌菌液倒至平皿，混合均匀后将多余的大肠杆菌和沙门氏菌菌液吸出，在超净台中打开平皿盖置于酒精灯旁吹约20分钟。
55.打孔：平板干燥后，用打孔器在在平板中打直径为5-6mm、边缘整齐的小孔；
56.培养：取50-80μl ts1活化菌液至孔内，待菌液完全吸收后，置于37℃恒温箱培养18h-20h。
57.结果如图5所示，有抑菌圈，短小芽孢杆菌ts1对革兰氏阴性菌有良好的抑菌效果。
58.实施例6：短小芽孢杆菌ts1对革兰氏阳性菌的体外抑菌试验
59.致病菌的培养：链球菌和金黄色葡萄球菌的培养同ts1复苏、活化过程类似，最终与ts1同步进行摇菌得到活化菌液；
60.致病菌稀释：取五个10ml离心管，每管加入4.5ml无菌pbs，取500μl菌液加入第一个管中混匀，再取第一管中500μl稀释菌液，加入第二管中混匀
……
依次类推进行梯度稀释，得到浓度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
的致病菌菌液。
61.铺板子：将lb营养琼脂平板在超净台酒精灯等旁吹5-10分钟后，将稀释好的链球菌和金黄色葡萄球菌菌液倒至平皿，混合均匀后将多余的链球菌和金黄色葡萄球菌菌液吸出，在超净台中打开平皿盖置于酒精灯旁吹约20分钟。
62.打孔：平板干燥后，用打孔器在在平板中打直径为5-6mm、边缘整齐的小孔；
63.培养：取50-80μl ts1活化菌液至孔内，待菌液完全吸收后，置于37℃恒温箱培养18h-20h。
64.结果如图6所示，有抑菌圈，短小芽孢杆菌ts1对革兰氏阳性菌有良好的抑菌效果。
65.实施例7：添加ts1的饲料喂养对鸡体重的影响
66.取20只鸡随机分成对照组和实验组两组。实验组的饲料中添加ts1，连续饲喂15天，饲料添加量为109cfu/只/天；对照组用同样的方法喂养15天，饲料中无ts1。在第6、8、10、12、14、16、18和20天测量两组鸡的体重，并记录。
67.鸡的体重随天数的增加而增加，添加ts1的组明显比不添加饲料的对照组体重更重，两组之间有显著差异(*表示p《0.05)
68.本技术提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本技术总的构思下的几个示例，并不构成本技术保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本技术方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本技术的保护范围。