与绿豆抗豆象相关的SNP分子标记及其在遗传育种中的应用

与绿豆抗豆象相关的snp分子标记及其在遗传育种中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，尤其涉及与绿豆抗豆象相关的snp 分子标记及其在遗传育种中的应用。


背景技术：

2.绿豆(vigna radiata(linn.)wilczek.)，在中国已有两千年的栽培史，是我国重要的粮食作物。近年来，随着种植业结构的调整和人们膳食结构的改变，人们对绿豆的需求量日益增加，种植面积逐年扩大。研究表明病虫害严重影响绿豆种子萌发和产量等方面。鉴于此，深入研究抗豆象绿豆品种中参与抗豆象的基因及抗虫机理，对筛选抗豆象能力较强的优势品种及抗豆象育种材料的筛选具有十分重要的意义。
3.绿豆象(callosobruchus chinensis linnaeus)属鞘翅目，豆象科，瘤背豆象属，是一种世界性的仓储害虫。主要取食富含碳水化合物、蛋白质而少脂肪的豆类作物，如绿豆、小豆、豇豆、蚕豆、豌豆、鹰嘴豆，其中尤其偏爱绿豆。绿豆象初次侵害一般发生在田间，成虫食花粉，可在绿豆荚上产卵，随豆入库，继续危害；成虫羽化后可引起二次侵害，乃至多次侵害，严重时，引起霉变，甚至导致仓内绿豆全部报废，失去使用价值。另外绿豆象繁殖能力强，发生后难以清除，危害严重。因此，有必要选育抗豆象绿豆品种，而利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是提高抗病虫育种选择效率和准确性的有效手段。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的问题是如何鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性。
5.为了解决以上技术问题，本发明首先提供了检测绿豆基因组中snp位点的多态性或基因型的物质的应用。
6.本发明所提供的应用为检测绿豆基因组中snp位点的多态性或基因型的物质在如下任一种中的应用，
7.(1)鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性；
8.(2)筛选或选育抗豆象的绿豆单株或株系或品系或品种；
9.(3)筛选或选育感豆象的绿豆单株或株系或品系或品种；
10.(4)绿豆育种；
11.(5)制备鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性的产品；
12.(6)制备筛选或选育抗豆象的绿豆单株或株系或品系或品种的产品；
13.(7)制备筛选或选育感豆象的绿豆单株或株系或品系或品种的产品；
14.(8)制备绿豆育种的产品；
15.所述snp位点为绿豆4号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为t或c，为序列表中序列3的第164位核苷酸。
16.以中绿5号基因组序列为参考基因组，所述snp位点为绿豆4号染色体10060247bp 处(具体为序列表中序列3第164位)。
17.本发明还提供了鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性的方法。
18.本发明所提供的鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性的方法包括检测待测绿豆基因组中所述snp位点的基因型，根据所述基因型鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性，所述基因型为tt、tc或cc，所述tt是所述snp位点为t的纯合型，所述cc是所述snp位点为c 的纯合型，所述tc是所述snp位点为t和c的杂合型。
19.可选地，根据上述方法，所述鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性为如下任一种方式：
20.(1)所述snp位点的基因型为tt或tc的待测绿豆为或候选为抗豆象的绿豆，
21.(2)所述snp位点的基因型为cc的待测绿豆为或候选为感豆象的绿豆；
22.(3)所述snp位点的基因型为tt或tc的待测绿豆的豆象抗性高于所述snp位点的基因型为cc的待测绿豆。
23.作为一种实施方案，所述鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性的方法可包括如下步骤：
24.(1)以待测绿豆的基因组dna为模板，采用引物组合物进行测序；所述引物组合物由引物a和引物b组成；
25.所述引物a为核苷酸序列是序列表中序列1的单链dna分子；
26.所述引物b为核苷酸序列是序列表中序列2的单链dna分子；
27.(2)完成步骤(1)后，确定待测绿豆的所述snp位点的基因型；
28.(3)根据基因型结果进行鉴定待测绿豆的豆象抗性：所述snp位点的基因型为 tt或tc的待测绿豆的豆象抗性高于所述snp位点的基因型为cc的待测绿豆。
29.上述方法中，pcr反应程序可为：第一步：95℃预变性5min；第二步：95℃变性 30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，32-35个循环；第三步：72℃延伸5min。
30.上述的方法在绿豆育种中的应用也属于本发明的保护范围。
31.本发明还提供了绿豆育种的方法。
32.本发明所提供的绿豆育种的方法为m1或m2：
33.m1、所述方法包括检测绿豆基因组中所述snp位点的基因型，选择所述snp位点的基因型为tt或tc的绿豆作为亲本进行育种，所述tt是所述snp位点为t的纯合型，所述tc是所述snp位点为t和c的杂合型，所述方法育种的目标包括选育具有豆象抗性的绿豆；
34.m2、所述方法包括检测绿豆基因组中所述snp位点的基因型，选择所述snp位点的基因型为cc的绿豆作为亲本进行育种，所述cc是所述snp位点为c的纯合型，所述方法的育种的目标包括选育感豆象的绿豆。
35.作为一种实施方法，绿豆育种的方法可包括如下步骤：
36.(1)以待测绿豆的基因组dna为模板，采用上述引物组进行pcr扩增；
37.(2)完成步骤(1)后，进行测序，确定待测绿豆所述snp位点的基因型；
38.(3)选择tt基因型绿豆进行抗豆象育种。
39.本发明还提供了用于检测绿豆基因组中snp位点的多态性或基因型的产品。
40.本发明所提供的用于检测绿豆基因组中所述snp位点的多态性或基因型的产品，包括上述检测绿豆基因组中snp位点的多态性或基因型的物质，所述产品可为如下任一种：
41.c1)检测绿豆豆象抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
42.c2)鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性的产品；
43.c3)用于绿豆育种的产品；
44.c4)筛选或选育抗豆象的绿豆单株或株系或品系或品种的产品；
45.c5)筛选或选育感豆象的绿豆单株或株系或品系或品种的产品；
46.上述应用、方法和产品中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述snp位点的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。
47.可选地，所述物质为如下d1)、d2)或d3)：
48.d1)所述物质为扩增包括所述snp位点在内的绿豆基因组dna片段的引物组合物；
49.d2)所述物质为含有d1)所述引物组合物的pcr试剂；
50.d3)所述物质为含有d1)所述引物组合物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。
51.可选地，所述扩增可为pcr扩增。所述引物组合物由所述引物a和所述引物b组成。
52.本发明还提供了dna分子，核苷酸序列如序列表的序列3所示。
53.上述的dna分子的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用具体为在如下任一中的应用：
54.(1)鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性；
55.(2)筛选或选育抗豆象的绿豆单株或株系或品系或品种；
56.(3)筛选或选育感豆象的绿豆单株或株系或品系或品种；
57.(4)绿豆育种；
58.(5)制备鉴定或辅助鉴定绿豆豆象抗性的产品；
59.(6)制备筛选或选育抗豆象的绿豆单株或株系或品系或品种的产品；
60.(7)制备筛选或选育感豆象的绿豆单株或株系或品系或品种的产品；
61.(8)制备绿豆育种的产品。
62.可选地，在上述应用中，该dna分子作为检测靶标。
63.本文中，抗豆象的绿豆的豆象抗性高于感豆象的绿豆。
64.本文中，抗豆象的绿豆具体也可为种子被害率小于等于65的绿豆。
65.本文中，感豆象的绿豆具体也可为种子被害率大于65的绿豆。
66.本发明所述的豆象可为如下任一种：1)豆象科(bruchidae)昆虫；2)瘤背豆象属(callosobruchus)昆虫；3)绿豆象callosobruchus chinensis(linnaeus)。
67.本发明中，所述育种的目标可包括培育具有豆象抗性的绿豆。
68.可将检测所述snp位点多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与绿豆抗豆象相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定绿豆对豆象的抗性产品。
69.本发明提供了一种与绿豆豆象抗性显著相关联的snp分子标记，该分子标记检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高不同豆象抗性绿豆品种的鉴定效率。本发明可用于辅助鉴定绿豆对豆象的抗性，可以对筛选绿豆进行早期筛选，可用于绿豆分子标记辅助育种。本发明具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定等优点，在发掘抗豆象绿豆种质资源和选育抗豆象绿豆品种的研究中具有重要的应用价值。
具体实施方式
70.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
71.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
72.抗豆象鉴定分级标准见表1。
73.表1绿豆抗豆象特性分级标准
[0074][0075][0076]
籽粒被害率＝被害种子粒数/50*100(本实验每份材料随机选取50粒种子，总粒数＝50)
[0077]
实施例1利用snp检测绿豆豆象病抗性
[0078]
1、绿豆豆象病抗性关联snp标记的发掘
[0079]
从全球绿豆核心种质资源中选取350份绿豆品种(表2)作为实验材料鉴定豆象抗性。每份材料随机选取50粒健康种子，包括2份感豆象中绿1号(每份各50 粒)作为对照，置于抗豆象鉴定室塑料箱内，温度保持在25℃-29℃之间，湿度控制在70％-80％之间。每个塑料箱内放入400-500头刚羽化1-3天的绿豆象成虫，让其随机产卵，当每粒种子落卵量在5个以上时，除去成虫。40-45天后调查抗虫种子粒数及抗虫率，参照程须珍等(《绿豆种质资源描述规范和数据标准》2006)的方法对每个单株进行抗性评价。达到中抗以上材料进行重复鉴定，设3次重复。对上述绿豆种质资源进行重测序，获得了有648408个高质量snp标记。
[0080]
结合上述测定的绿豆种子豆象抗性和该群体的648408个snp标记，采用gemma 软件进行全基因组关联分析(genome wide association study,gwas)分析，结果显示位于第4号染色体上的一个snp标记与绿豆种子豆象抗性显著关联，该snp位于第4号染色体的第10060247个碱基处，可在两个年度中重复检测，-log10(p)值均大于30(-log10(p)＝34.7)，所述snp位点为碱基t和c的差异。该snp位点(简称snp-10060247)及其附近的核苷酸如序列表的序列3所示，其中第164位核苷酸为 snp位点，为c/t多态。序列3中，y为c或t。该snp位点的基因型有如下三种：cc、 tc或tt。所述cc是所述snp位点为c的纯合型，所述tt是所述snp位点为t的纯合型，所述tc是所述snp位点为t和c的杂合型。该snp位点基因型为tt或tc的绿
豆品种的豆象抗性显著高于该snp位点基因型为cc绿豆品种。
[0081]
(4)单倍型分析
[0082]
结合snp标记与350份供试材料的绿豆豆象抗性表型数据进行基因型分析，结果如表2所示。其中，snp分型共分为三个组，分别为cc、ct和tt型，tt和ct 基因型绿豆豆象抗性显著高于cc型绿豆基因型。
[0083]
2、绿豆豆象抗性检测方法的建立
[0084]
根据上述snp位点信息，结合绿豆全基因组序列信息，开发snp标记引物，上游引物f为序列表中序列1：5
’‑
gaatggtaagtgttctgcaat-3’；下游引物r为序列表中序列2：5
’‑
tcaccagaagatgagaatgctc-3’。扩增大小为237bp，所述snp位点位于扩增片段的第164bp处，利用上述引物组合物对绿豆第4号染色体第10060247 位碱基处碱基的变异(snp-10060247)进行检测。
[0085]
2.1提取待测绿豆的叶片的基因组dna
[0086]
以苗期新鲜叶片为材料，采用ctab法提取dna，详细步骤如下：
[0087]
1)加入800μl ctab混合提取液，涡旋震荡1min使其混合均匀，将离心管置于65℃水浴锅中，水浴45min-1h。
[0088]
2)加入800μl氯仿/异戊醇(v/v＝24：1)溶液，混匀15min。
[0089]
3)在恒温离心机中10000rpm离心10min，取600μl上清液(可以取少量)移入相应编号的2ml离心管。
[0090]
4)加入95％的乙醇900μl和300μl 5m nacl，然后缓慢翻转2min，放于-20℃冰箱30min。离心管中会呈现出白色絮状物，然后10000rpm离心10min，倒掉上清液，留下沉淀。
[0091]
5)加入500μl 90％乙醇于离心管，浸泡5～7min后10000rpm离心5min。
[0092]
6)倒掉上清液，室温下干燥后，加入200μl的超纯水，使dna溶解，-20℃保存备用。
[0093]
2.2pcr
[0094]
pcr扩增反应体系包括：40ng dna，1
×
taq酶缓冲液(10mm tris-hcl，ph8.8； 10mm kcl；10mm(nh4)2so4；1.5mm mgcl2；0.1％triton x-100)，1mm dntps，上、下游引物各0.25μm和1u taq dna聚合酶，ddh2o补至10μl。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，32-35个循环；最后72℃延伸5min。
[0095]
反应结束后将反应产物测序进行基因分型鉴定，结果显示snp位点变异如表2 所示。包括10份高抗、9份中抗和331份高感豆象材料。根据基因型结果鉴定待测绿豆品种的豆象抗性：snp位点的基因型有如下三种：cc、tc或tt。所述cc是 snp-10060247为c的纯合型，所述tt是snp-10060247为t的纯合型，所述tc是 snp-10060247为t和c的杂合型。若待测绿豆品种的基因型为tt或tc，则该待绿豆品种为抗豆象绿豆；若待测绿豆品种的基因型为cc，则该待测绿豆品种为感豆象绿豆。同时，从表3中可以看出：豆象抗性性状中，纯合tt基因型绿豆的豆象抗性极显著大于ct基因型和cc基因型的绿豆豆象抗性(p《0.01)，杂合ct基因型与纯合cc 基因型的豆象抗性差异都极显著。
[0096]
本发明利用snp-10060247鉴定绿豆豆象抗性表型鉴定与基因型的绿豆豆象抗性鉴定结果一致。因此，利用检测绿豆基因组中snp-10060247的多态性或基因型的分子标记可以用于绿豆豆象抗性分子标记辅助选择，以提高选择的准确度。
[0097]
抗豆象种子所占比例(％)＝1-籽粒受害率(％)，籽粒被害率(％)＝被害种子粒
数/50*100(本实验每份材料随机选取50粒种子，总粒数＝50)
[0098]
表2 350份绿豆品种豆象抗性的表型和基因型信息
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
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[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111][0112]
表3绿豆第4号染色体第10060247个碱基c》t位点基因型与豆象抗性关联分析
[0113]
基因型数量抗豆象种子所占比例(％)tt1089.5
±
6.07act980.56
±
5.5bcc3310.363
±
1.657c[0114]
注：同列上标不同字母表示差异显著(p《0.01)
[0115]
在选育豆象抗性绿豆品种时，最好选择所述snp位点的基因型为tt或tc的绿豆作为亲本进行育种；在选育感豆象绿豆品种时，最好选择所述snp位点的基因型为cc 的绿豆作为亲本进行育种。
[0116]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。