基因DSF1及其编码蛋白质在植物抗旱过程中的应用

本发明属于基因工程应用，具体涉及基因dsf1及其编码蛋白质在植物抗旱过程中的应用。

背景技术：

1、水稻、小麦、玉米是世界上非常重要的农作物，为人类的生存提供了基础的保障。其中水稻作为具有较高经济和社会价值的粮食作物，受到人们的广泛关注，也常被用来研究逆境条件下植物内部的响应以及相关抗性基因的功能。

2、随着全球经济的快速发展，人口数量也在不断的增加，对粮食作物的需求急剧加大，水稻作为世界上最重要的农作物之一，其产量受到多种非生物胁迫的影响。而干旱是导致水稻产量降低的主要非生物胁迫之一。当植物处于干旱条件时，为了生存植物会启动自身多种机制去抵抗不适的环境，例如逆境胁迫相关转录因子的上调，植物体内相关激素水平的增加等。虽然目前对水稻干旱胁迫的研究有很多，但在干旱处理诱导的基因中，许多基因的功能仍然是未知的。近年来，转基因技术不断发展，研究者们利用转基因技术改造部分功能基因来增强水稻对干旱等逆境胁迫的耐受性，以便在干旱胁迫等条件下维持作物产量的稳定。

3、在长期的进化过程中植物自身进化出多个抵抗干旱胁迫的机制，其中植物激素是比较重要的一种方式。植物激素aba作为植物逆境胁迫激素被人们研究较多。当植物处于干旱胁迫条件下时，植物不同器官会局部产生aba，其中叶肉细胞产生aba的效率高于根部组织，从而调控干旱胁迫相关转录因子的表达，提高植物对干旱的耐受性。水稻基因dsf1(drought stress factor 1)是一个功能未知的基因，该基因启动子序列含有三个aba响应元件abre(aba response elements)，有研究报道abre元件可以感知aba介导的渗透胁迫响应，说明dsf1基因可能参与了aba信号通路。根据已有的研究结果可知，aba在植物的生长发育、抗逆、种子休眠等多个方面都具有非常重要的作用。因此，水稻基因dsf1可能通过参与aba信号通路从而调控水稻对干旱胁迫的耐受性。所以对水稻基因dsf1及其编码蛋白功能的研究是十分有必要的，对于培育水稻耐旱新品种具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供基因dsf1及其编码的蛋白质在植物抗旱过程中的新应用，从而为培育耐旱植物新品种提供思路。

2、本发明的一个参与调节植物对干旱胁迫耐受性的基因，其核苷酸序列如序列表seq id no：1所示。

3、本发明的一个参与调节植物对干旱胁迫耐受性的新蛋白，其蛋白序列如序列表seq id no：2所示。

4、本发明的一个参与调节植物对干旱胁迫耐受性的新蛋白，其蛋白序列在多个高等植物中具有较高的相似性，功能比较保守且未知。

5、本发明的dsf1基因来源于重要的农作物水稻，可通过基因过程手段筛选抗逆的作物新品种。

6、本发明的dsf1基因获取方式为：

7、一、水稻总rna的提取

8、选取水稻日本晴(oryza sativa l.cv nipponbare)(百格基因公司赠送)采用rnaiso试剂(takara)，按照相关说明书进行操作提取水稻叶片总rna。用紫外分光光度计测定并计算rna的浓度和纯度，冻存于-80℃。

9、二、dsf1基因完整编码区序列的获得

10、将所提的水稻叶片总rna采用反转录全长cdna的试剂盒进行反转录获得水稻叶片全长cdna。将拟南芥atgip1蛋白氨基酸序列通过ncbi进行blast，在水稻中找到与其同源的蛋白，该蛋白由os03g17140基因编码，并将其命名为dsf1(drought stress factor 1)。根据网站预测的编码dsf1蛋白的基因序列设计引物，以反转录的全长cdna作为模板扩增dsf1基因全长。进一步将相应pcr产物割胶回收进行测序分析，将测序结果与网站预测的序列进行分析确认所获序列正确无突变。

11、三、dsf1突变体植株的筛选

12、以水稻日本晴wt作为材料，采用crispr/cas9技术来构建突变体材料。通过网站http：//skl.scau.edu.cn/primerdesign/设计cas9蛋白针对dsf1基因的靶序列(grna)，选取脱靶率低的靶序列，选取双元载体pregb32作为目标载体，在t4-dna连接酶的作用下将所设序列构建在bsai单酶切的prgeb32双元载体上。把构建好的载体送百格基因公司进行转化。四、干旱处理实验

13、将水稻种子去除种皮后进行萌发，再将水培7天后的小苗转移到营养土中继续生长。对土中正常生长两个月的水稻wt和通过crispr/cas9技术敲除的突变体植株dsf1进行脱水处理，即在其生长过程中不再补充水分，干旱处理21天，拍照记录干旱处理后的表型。随后给处理后的植物材料补充水分7天，即复水过程，拍照记录复水第7天的表型，对处理前后wt和突变体植株的长势进行比较分析，wt为对照组，突变体为实验组。

14、对于水稻基因dsf1，在此之前该基因及其编码的蛋白功能无任何报道。本发明研究发现该基因编码的蛋白dsf1在植物细胞质基质中有表达，且主要存在于水稻的叶片细胞中，说明该蛋白在水稻营养生长阶段发挥作用。

15、基因dsf1及其编码的蛋白质在植物抗旱过程中的应用，所述水稻基因dsf1参与了水稻对干旱胁迫的耐受性，在将该基因功能通过crispr/cas9技术沉默后，突变体植株对干旱胁迫的敏感性发生改变，其对干旱胁迫的耐受性增强。

16、进一步的实验研究表明，所述基因启动子区域含有abre元件，说明该基因可能通过参与aba信号通路调控植物对干旱的响应。

17、可预期地，将其他植物中该基因的同源基因进行敲除，可获得耐旱植物新品种。

技术特征：

1.一个参与调节水稻对干旱胁迫耐受性的基因dsf1，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表seq id no：1所示。

2.一个参与调节水稻对干旱胁迫耐受性的蛋白dsf1，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no：2所示。

3.基因dsf1及其编码的蛋白质在植物抗旱过程中的应用，其特征在于，该蛋白是一个定位于植物细胞质基质的蛋白。

4.如权利要求3所述的基因dsf1及其编码的蛋白质在植物抗旱过程中的应用，其特征在于，dsf1基因启动子序列含有三个响应aba的abre元件。

5.如权利要求3所述的基因dsf1及其编码的蛋白质在植物抗旱过程中的应用，其特征在于，dsf1蛋白可能通过参与aba信号通路进而调控水稻对非生物胁迫的响应。

6.如权利要求3所述的基因dsf1及其编码的蛋白质在植物抗旱过程中的应用，其特征在于，该基因沉默后突变体植株对干旱胁迫的敏感性发生变化。

7.如权利要求3所述的基因dsf1及其编码的蛋白质在植物抗旱过程中的应用，其特征在于，dsf1基因功缺失突变体表现出比野生型更强的干旱耐受性。

技术总结
本发明发现了一个调节植物对干旱胁迫耐受性的新蛋白，具体涉及水稻基因DSF1(Os03g17140)及其编码蛋白质在培育水稻耐旱新品种方面的应用。该基因对水稻干旱胁迫处理存在明显响应，可调控水稻对干旱胁迫的耐受性。本发明通过对DSF1基因启动子序列分析发现，该基因启动子序列含有三个植物激素脱落酸(abscisic acid，ABA)响应元件ABRE，说明该基因可能参与ABA信号通路从而调控水稻对非生物胁迫的响应，在水稻抗逆方面具有很大的潜在应用价值。发明人通过CRISPR/Cas9技术对水稻基因DSF1功能进行沉默，发现突变体提高了水稻对干旱胁迫的耐受性。通过将水稻中DSF1基因功能沉默，可以获得水稻耐旱转基因新品种，本发明为培育抗旱转基因作物新品种提供了理论基础。

技术研发人员：卢山,孔梦娟,景云鹤,黄娜,吕德新
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15