长尾科副溶血性弧菌噬菌体VPP1及其应用

长尾科副溶血性弧菌噬菌体vpp1及其应用
技术领域
1.本发明涉及胶体金比色技术领域，具体涉及一株长尾科副溶血性弧菌噬菌体vpp1及其应用。


背景技术：

2.副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus，vp)是一种引起食源性疾病的重要病原菌，容易污染海产品等食品，在夏秋季的沿海及港口地区容易检出。国家食源性疾病监测网数据显示，副溶血性弧菌作为导致食源性微生物中毒的病原菌，目前在暴发规模、群体接触规模皆呈现明显上升趋势。
3.噬菌体作为细菌的天敌，广泛生存与自然界中，自然环境中噬菌体的数量约为10
30
～10
31
个。随着人们对食品安全的重视，采用噬菌体作为新型生物制剂来防控细菌的感染成为研究的热点。全球变暖导致副溶血性弧菌感染的地理范围和频率不断增加，人类通过食用被副溶血性弧菌污染的海鲜食品而导致感染，因此寻找一种有效且安全的副溶血性弧菌抗菌策略迫在眉睫，噬菌体的发现为人类抵御细菌的危害开辟了一条新路径。
4.金纳米颗粒(gold nanoparticles，aunps)具有独特的光学特性即表面等离子体共振的特性，并且易于合成和功能化。因此在稳定的胶体金体系中，加入噬菌体后，噬菌体主要通过静电吸附作用与胶体金发生结合，受噬菌体的保护，使得在高浓度盐离子溶液中的胶体金不会发生聚集。添加副溶血性弧菌后，噬菌体通过特异性识别并大量吸附到副溶血性弧菌表面，同时胶体金脱离了噬菌体的保护作用而发生聚集。用肉眼可以观察到胶体金由酒红色不断加深变成紫色、蓝色，同时通过紫外分光光度计测定其紫外吸收光谱图，可以发现其最高紫外吸收峰发生红移的现象。因此，通过肉眼观察颜色变化和比色分析紫外吸收光谱图(a
660
/a
520
)的比值可以实现对副溶血性弧菌的定性和定量检测。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一株长尾科副溶血性弧菌噬菌体vpp1及其应用。
6.为实现上述目的，本发明所设计一株副溶血性弧菌噬菌体vpp1，所述噬菌体vpp1命名为vibrio parahaemolyticus bacteriophage vpp1，其保藏编号：cctcc no：m2022575。
7.上述副溶血性弧菌噬菌体(vibrio parahaemolyticus bacteriophage)vpp1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2022575，保藏日期为2022年5月10日，地址：中国武汉武汉大学。
8.上述副溶血性弧菌噬菌体(vibrio parahaemolyticus bacteriophage)vpp1从武汉市海鲜市场鲍鱼样品中分离纯化得到，其特异性强，能够识别不同的副溶血性弧菌，而不识别其他种属的细菌；使用透射电子显微镜观察其形态，所述噬菌体vpp1属于长尾科(siphoviridae family)噬菌体；其具有快速吸附副溶血性弧菌的特点(9min可达到最大吸
附速率)；且具有高ph稳定性(4～11)和热稳定性(30～60℃)。
9.本发明还提供了一种上述副溶血性弧菌噬菌体vpp1在快速检测副溶血性弧菌中应用。
10.本发明还提供了一种胶体金颗粒-噬菌体vpp1偶联物phage-aunps的制备方法，包括以下步骤：
11.1)将噬菌体vpp1活化；
12.2)通过柠檬酸钠还原法制备得到胶体金，其中，胶体金的粒径为10～15nm；
13.3)将活化好的噬菌体vpp1与胶体金进行偶联，得到副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物。
14.进一步地，所述步骤1)中，噬菌体vpp1活化具体方法如下：
15.从﹣80℃的冰箱里分别取出甘油管保藏的副溶血性弧菌噬菌体与相应的对数期宿主菌菌液各取100μl加入至15ml lb液体培养基中培养12～18h，将培养好的混合液于4℃下8500r/min离心15min，上清液用0.22μm的滤膜过滤除去宿主菌，得到活化好的噬菌体液，保存于4℃冰箱备用。
16.再进一步地，所述步骤2)中，胶体金制备方法如下：
17.在250ml的圆底烧瓶中加入100ml浓度为1mm的氯金酸(haucl4)。加热至刚好沸腾状态后，在剧烈搅拌的条件下，立即将10ml浓度为38.8mm柠檬酸钠溶液快速地加入，反应10min后，可观察到溶液的颜色逐步由浅黄色变为黑色、紫色，最后变成酒红色；此时，停止加热，并持续搅拌15min，待自然冷却至室温后，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，即制得的胶体金颗粒溶液，4℃冷藏备用。
18.再进一步地，所述步骤3)中，偶联方法如下：
19.a.将活化好的噬菌体vpp1原液离心，去除上液，再用无菌水进行重悬，并用微孔滤膜过滤得到高滴度的噬菌体vpp1原液(可通过双层平板法确定噬菌体的滴度)，4℃冷藏备用。
20.b.将制备好的胶体金颗粒溶液的ph值调至5.5～8.5，加入噬菌体vpp1原液结合35min；离心去上清液，用等体积超纯水重悬金纳米颗粒沉淀物，即得到副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物phage-aunps。
21.本发明还提供了一种快速检测副溶血性弧菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述方法制备的副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物phage-aunps。
22.本发明还提供了一种利用上述的试剂盒快速检测副溶血性弧菌的比色法，包括以下步骤：
23.1)将副溶血性弧菌atcc 33846活化，然后制备不同浓度的副溶血性弧菌atcc 33846溶液；
24.2)将副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物phage-aunps分别加入不同浓度的副溶血性弧菌atcc 33846溶液中混合，孵育35min后分别加入10μl不同浓度的nacl，观察颜色变化，并置于紫外分光光度计中检测，分别记录520nm和660nm处的吸光值，分析吸光度a
660
/a
520
比值变化，建立以菌液浓度为横坐标，吸光度a
660
/a
520
比值为纵坐标的标准曲线；
25.3)将待检测样品与副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物phage-aunps混合，孵育35min后分别加入10μl不同浓度的nacl，观察颜色变化，检测记录520nm和660nm处的吸光
值，分析吸光度a
660
/a
520
比值，根据上述标准曲线，得到该待检测样品中副溶血性弧菌的含量。
26.本发明还提供了一种上述的试剂盒在人工污染副溶血性弧菌湖水中的应用。
27.本发明还提供了一种上述的试剂盒在人工污染副溶血性弧菌小龙虾检测中的应用。
28.本发明原理：
29.在稳定的胶体金体系中，加入噬菌体后，噬菌体主要通过静电吸附作用与胶体金发生结合，受噬菌体的保护，使得在高浓度盐离子溶液中的胶体金不会发生聚集。添加副溶血性弧菌后，噬菌体通过特异性识别并大量吸附到副溶血性弧菌表面，同时胶体金脱离了噬菌体的保护作用在na
+
离子诱导下聚集变色。用肉眼可以观察到胶体金由酒红色不断加深变成紫色、蓝色，同时通过紫外分光光度计测定其紫外吸收光谱图，可以发现其最高紫外吸收峰发生红移的现象。因此，通过肉眼观察和对紫外吸收光谱图(a
660
/a
520
)的分析可以实现对副溶血性弧菌的定性和定量检测。
30.本发明的有益效果：
31.(1)柠檬酸钠还原法制备出的胶体金呈现澄清透明的酒红色，通过紫外分光光度计、纳米粒度电位仪和透射电子显微镜表征，发现其紫外吸收光谱图测定电位大小为-33.70mv，测定出其粒径大小为15.2nm。
32.(2)对噬菌体vpp及胶体金建立的比色法进行条件优化：最佳ph值为7.5，噬菌体vpp1最佳结合浓度为5.37
×
108pfu/ml，噬菌体结合量在4.36
×
108pfu/ml，结合成功率可达68.72％，噬菌体和胶体金最佳吸附时间为35min，nacl最佳加入终浓度为54.54mm，噬菌体-胶体金复合物特异性吸附宿主菌最佳时间为35min，检测特异性为100％。
33.(3)优化条件下成功开发了一种噬菌体vpp1为生物识别元件与胶体金建立比色法快速检测副溶血性弧菌研究，并将其应用于湖水和小龙虾中副溶血性弧菌的检测：标准方程为y＝0.08696x+0.2711，r2＝0.9561。该方法灵敏度高(lod＝89cfu/ml)，快速(检测时间为70min)，可靠(回收率分别为77.42％～123.72％和77.08％～119.35％)，线性范围广(8.9
×
101～8.9
×
109cfu/ml)。
34.综上所述，本研究以副溶血性弧菌为宿主菌从海鲜样品中分离纯化出噬菌斑形态一致且宿主谱较广的一株噬菌体即vpp1，研究其生物学特性，随后建立噬菌体vpp1介导胶体金聚集的副溶血性弧菌比色法，并将建立的方法应用于湖水和小龙虾样品中副溶血性弧菌的检测，本研究的方法灵敏度高，准确度高，用肉眼即可直接判断结果，比色测定进行定量，开拓了噬菌体在食源性病原菌检测方面的应用范围。
附图说明
35.图1：噬菌体vpp1以副溶血性弧菌atcc 33846为宿主菌的噬菌斑图片；
36.图2：噬菌体vpp1的透射电镜照片；
37.图3：噬菌体vpp1生物学特性，
38.图中，a：噬菌体vpp1的最佳感染复数，
39.b：噬菌体vpp1吸附速率曲线，
40.c：噬菌体vpp1一步生长曲线，
41.d：噬菌体vpp1的温度稳定性，
42.e：噬菌体vpp1的ph稳定性；
43.图4：胶体金的表征，
44.图中，a：aunps的紫外可见吸收光谱图，
45.b：aunps的粒径分布图，
46.c：aunps的zeta电位图，
47.d和e：aunps的透射电子显微镜照片；
48.图5：最佳ph值的优化，
49.图中，a：最佳ph值优化的紫外吸收光谱图，
50.b：最佳ph值优化的a
660
/a
520
变化图；
51.图6：噬菌体vpp1最佳加入量优化，
52.图中，a：噬菌体最佳加入量的紫外吸收光谱图，
53.b：噬菌体最佳加入量的a
660
/a
520
变化图；
54.图7：噬菌体和胶体金最佳结合时间，
55.图中，a：最佳结合时间的紫外吸收光谱图，
56.b：噬菌体最佳吸附时间的a
660
/a
520
变化图；
57.图8：噬菌体结合量；
58.图9：氯化钠最佳浓度优化的紫外吸收光谱对比图；
59.图10：胶体金对宿主菌活性影响的测定；
60.图11：噬菌体-胶体金复合物特异性结合宿主菌时间优化，
61.图中，a：结合宿主菌时间优化的紫外吸收光谱图，
62.b：结合宿主菌时间优化的a
660
/a
520
变化图；
63.图12：检测不同菌量的紫外吸收光谱图，
64.图中a～j含义：副溶血性弧菌atcc 33846的菌浓度从0cfu/ml、8.9
×
100～8.9
×
108cfu/ml；
65.图13：比色法检测的透射电镜表征图；
66.图14：比色法的标准曲线；
67.图15：可视化快速检测方法的特异性评估，
68.图中，a：特异性分析的紫外吸收光谱图，
69.b：特异性分析的a
660
/a
520
对比图；
具体实施方式
70.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
71.实施例1噬菌体分离和筛选、纯化富集及形态学分析
72.1.噬菌体vpp1分离和筛选
73.采集武汉市武商超市鲍鱼样品，将样品碾碎并与生理盐水混合，滤纸过滤，取5ml滤液与5ml培养至对数期的副溶血性弧菌atcc 33846于20ml lb中过夜培养12h，经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液按照上述方法重复一次，得到噬菌体原液。分离鉴定噬菌体的有无采用双层平板法，将培养6～8h的副溶血性弧菌atcc33846 100μl，噬菌体原液100μl与3.8ml 45
～50℃的半固体培养基轻柔混合倒于la下层培养基上，待凝固后倒置于37℃培养箱培养6h左右。
74.如图1所示：图中出现透明圈，则证明噬菌体的存在。
75.2.噬菌体纯化增值
76.噬菌体vpp1通过与od
600
＝0.6的副溶血性弧菌atcc 33846的培养物共培养、过滤、离心获得的。副溶血性弧菌atcc 33846在37℃震荡(180rpm)培养8h后，将培养物按比例1:20接种到2个250ml的锥形瓶中，每个锥形瓶中都含有50ml lb。当细菌培养物的od
600
＝0.2时，每瓶加入约100μl 106pfu/ml噬菌体vpp1，大约在加入噬菌体3～4h后，噬菌体完成裂解并从宿主菌中释放，将裂解物在8000r/min，4℃离心20min，弃去沉淀物，将得到的含有噬菌体的溶液通过0.22μm滤膜过滤以除去残留的细菌，然后在40000r/min，4℃离心1h，弃去上清液，将含有噬菌体的沉淀重新悬浮于pbs溶液中，备用。
77.3.噬菌体形态学分析
78.将噬菌体采用磷钨酸负染色后，置于透射电子显微镜下观察噬菌体形态，具体操作步骤如下：铜网浸没于噬菌体悬液中10min后，用滤纸吸去多余液体，再将铜网置于0.5％的磷钨酸染料中染色，随后自然晾干，制备好的铜网在透射电子显微镜下观察噬菌体形态，并用软件digital micrograph demo 3.9.1测量其大小。
79.如图2所示：噬菌体vpp1属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科。它具有二十面体的头部，有规则的尾部形态，不可收缩；头部直径为65.79
±
2.31nm，尾部长度为161.72
±
2.85nm，尾部直径为9.32
±
0.45nm。
80.上述副溶血性弧菌噬菌体(vibrio parahaemolyticus enteritidis bacteriophage)vpp1(以下简称为：噬菌体vpp1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2022575，保藏日期为2022年5月10日，地址：中国武汉武汉大学。
81.实施例2噬菌体vpp1生物学特性分析
82.1.噬菌体vpp1宿主谱分析
83.噬菌体宿主谱的测定采用点样法：
84.取100μl od
600
＝0.6的待测定菌液加入到温热的半固体培养基中，混匀后倒入预先制备好的la平板上，待凝固后，取5μl效价为1
×
109pfu/ml的噬菌体滴加至上层平板表面，干燥后倒置于37℃培养箱培养4～6h，观察裂解情况，结果如表1。
85.表1噬菌体vpp1宿主谱
[0086][0087][0088]
注：atcc a
，american type culture collection；“++”strong intensity(clear plaque)；“+”weak intensity(opaque plaque)；
“‑”
no lytic activity(no plaque).
[0089]
2.噬菌体最佳感染复数(moi)
[0090]
感染复数(multiplicity of infection，moi)是指初始感染时噬菌体的数量与宿主菌数量的比值。按一定的moi值(0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000)将噬菌体与宿主菌混合，37℃培养3.5h，9000r/min离心10min，用双层平板法测定不同moi值对应的上清液中噬菌体效价。试验设3个平行。
[0091]
由图3a所示，噬菌体在moi＝1时，噬菌体效价达到最大，即噬菌体的最佳感染复数为1，表明噬菌体与宿主菌的数量按1:1比例混合时，可增殖出更多的噬菌体。
[0092]
3.吸附速率
[0093]
按最适moi值将新鲜噬菌体液与宿主菌悬液混合于离心管中，37℃摇床培养。从0min开始，每隔5min采用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。试验设3个平行。吸附速率＝1
–
(每个时间点未吸附的噬菌体效价/0min时噬菌体效价)
×
100％，噬菌体对宿主菌的吸附速率结果如附图3b所示。
[0094]
由图3b可以看出，噬菌体vpp1的最佳吸附速率为90.23％，达到最佳吸附速率的时间为9min，此时噬菌体以最大量吸附于宿主菌上。
[0095]
4.一步生长曲线
[0096]
噬菌体的一步生长曲线反映其生长规律。将噬菌体和宿主菌按最适moi值混合，37℃温育9min，使噬菌体吸附于细菌上，随后4℃、8000r/min离心2min，弃上清，用等体积lb重悬两次，以除去未吸附的噬菌体。将上述液体加入到9ml lb培养基中，并至于37℃摇床振荡培养，从0min开始，每隔10min取样300μl，8000r/min离心2min，采用双层平板法测定上清液中噬菌体的效价。试验设3个平行。从一步生长曲线图(图3c)可以看出噬菌体的潜伏期、裂解期、裂解量(裂解量＝裂解末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度)。噬菌体vpp1的潜伏期为20min、裂解期150min，裂解量119.62pfu/cell.
[0097]
5.噬菌体vpp1热稳定性分析
[0098]
将噬菌体原液稀释至效价为1
×
107pfu/ml，并分装于1ml无菌离心管中，将离心管分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中，0min、30min和60min时分别测定各管中噬菌体效价。试验设3个平行。由图3d可知，噬菌体vpp1在30～50℃温度范围内，培养30min后噬菌体vpp1与原始效价几乎一致，但是培养60min时，噬菌体vpp1在50℃效价开始降低；当噬菌体vpp1在60℃的环境下孵育1h之后，效价降低了一半；在70～90℃温度之间，随着温度的升高，噬菌体的效价急剧降低直至失活。
[0099]
6.噬菌体vpp1 ph稳定性分析
[0100]
取已知效价的噬菌体悬液(1
×
107pfu/ml)100μl加入到900μl不同ph值(2～13)的pbs缓冲液中，将其置于37℃水浴锅2h后测定各离心管中噬菌体的效价。试验设3个平行。由图3e可知，当ph值为5～9时，对噬菌体vpp1的活性的影响不大，并且在此范围内其效价波动较小。而处于ph＝3或10的环境下对vpp1进行2h的孵育后，其效价明显降低。当vpp1经过ph值为2或11的环境处理后，其活性完全丧失，说明噬菌体vpp1在强酸强碱的条件失去活性。
[0101]
实施例3胶体金(aunps)的制备
[0102]
1.玻璃仪器的清洗
[0103]
为避免制备的金纳米颗粒不纯净，在实验开始前需将实验所需的全部玻璃器皿用洗涤剂清洗干净后，放入烘箱干燥。再用新鲜制备的铬酸洗液浸泡72h以上，取出用超纯水冲洗三遍往上，放入烘箱干燥以供使用。
[0104]
2.胶体金的制备
[0105]
通过柠檬酸钠还原法制备得到胶体金，其中，胶体金的粒径为10～15nm，据参考文献中的方法进行制备。胶体金的制备过程如下：
[0106]
在250ml的圆底烧瓶中加入100ml浓度为1mm的氯金酸(haucl4)。加热至刚好沸腾状态后，在剧烈搅拌的条件下，立即将10ml浓度为38.8mm柠檬酸钠溶液快速地加入到圆底烧瓶中。进行10min反应后，可观察到溶液的颜色由浅黄色变为黑色、紫色，最后变成酒红
色。此时，停止加热，并持续搅拌15min。待自然冷却至室温后，用微孔滤膜(0.22μm)过滤，将所制得胶体金，放入4℃冷藏冰箱中备用。
[0107]
结果如图4所示：显示了aunps的表征结果。
[0108]
实施例4基于噬菌体介导胶体金聚集快速检测副溶血性弧菌比色法的建立
[0109]
1.噬菌体的增殖及预处理
[0110]
为了提高噬菌体和胶体金的稳定结合作用，需要增加噬菌体原液的滴度，同时去除lb培养液，改用无菌水作为噬菌体原液的重悬液。因此，将固体增殖后的噬菌体原液在4℃、40000r/min超速离心1h，离心结束后噬菌体会沉淀在离心管底部，用1ml无菌水进行重悬，并用0.22μm的微孔滤膜过滤得到高滴度的噬菌体原液(可通过双层平板法确定噬菌体的滴度)，放入4℃冷藏冰箱中备用。
[0111]
2.ph值优化
[0112]
胶体金的ph值会影响噬菌体vpp1与其结合的稳定性，从而影响检测方法的检出限和检测准确性。为了探究出最佳噬菌体和胶体金稳定结合的ph环境，根据噬菌体vpp1的ph值稳定性结果，当ph值在6～8之间，活性基本保持不变。因此将制备好的胶体金的ph值用0.1mol/l hci和0.1mol/l k2co3分别调至不同值(5.5～8.5)，加入22μl噬菌体vpp1(10
10
pfu/ml)结合35min，加入10μl 10％nacl，5min观察颜色变化，并用紫外分光光度计表征其紫外吸收光谱图，记录520nm和660nm处的吸光值，
[0113]
结果如图5所示，根据吸光度a
660
/a
520
比值变化选取最佳ph值为7.5。
[0114]
3.噬菌体加入量的优化
[0115]
将300μl制备好的胶体金的ph值用0.1mol/l hci和0.1mol/l k2co3调至7.5，分别加入不同量(4～28μl)的噬菌体vpp1(10
10
pfu/ml)并结合35min，加入10μl 10％nacl，5min后观察颜色变化，并用紫外分光光度计表征其紫外吸收光谱图，记录520nm和660nm处的吸光值，
[0116]
结果如图6所示，根据吸光度a
660
/a
520
比值变化选取最佳噬菌体vpp1加入量为22μl。
[0117]
4.噬菌体与胶体金结合时间优化
[0118]
噬菌体需要一定的时间才能完全与胶体金发生结合，需要探究出加入的所有噬菌体vpp1与胶体金稳定结合所需要的时间。将制备好的胶体金的ph值用0.1mol/l hci和0.1mol/l k2co3调至7.5，加入22μl的噬菌体vpp1(1010pfu/ml)并结合不同时间(5～60min)，加入10μl 10％nacl，5min后观察颜色变化，并用紫外分光光度计表征其紫外吸收光谱图，记录520nm和660nm处的吸光值，
[0119]
结果如图7所示，根据吸光度a
660
/a
520
比值变化选取噬菌体和胶体金的最佳吸附时间为35min。
[0120]
5.噬菌体偶联效果测定
[0121]
将制备好的胶体金的ph值用0.1mol/l hci和0.1mol/l k2co3调至7.5，加入22μl的噬菌体vpp1(1010pfu/ml)并结合35min，在4℃、10000r/min超速离心15min，离心结束后金纳米颗粒会沉淀在离心管底部，吸取上清液，同时用等体积超纯水重悬金纳米颗粒沉淀物，用双层平板法测定上清液和沉淀物的噬菌体的滴度。结果如图8所示，吸附成功率为68.72％。
[0122]
6.nacl最佳加入浓度优化
[0123]
将制备好的胶体金的ph值调制为7.5，加入22μl噬菌体vpp1(10
10
pfu/ml)孵育35min后分别加入10μl不同浓度的nacl(1.3～2.4m)，观察颜色变化，并用紫外分光光度计表征其紫外吸收光谱图；
[0124]
结果如图9所示，当加入的nacl浓度恰好使胶体金变色，此时nacl最佳加入浓度即为2.1m，即最佳nacl终浓度为54.54mm。
[0125]
实施例5
[0126]
快速检测副溶血性弧菌的试剂盒，包括副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物phage-aunps；其中，胶体金颗粒-噬菌体vpp1偶联物phage-aunps由以下方法制备而成：
[0127]
1.噬菌体vpp1活化具体方法如下：
[0128]
从﹣80℃的冰箱里分别取出甘油管保藏的副溶血性弧菌噬菌体与相应的对数期宿主菌菌液各取100μl加入至15ml lb液体培养基中培养12～18h，将培养好的混合液于4℃下8500r/min离心15min，上清液用0.22μm的滤膜过滤除去宿主菌，得到活化好的噬菌体液，保存于4℃冰箱备用。
[0129]
2.胶体金颗粒溶液的制备方法如下：
[0130]
在250ml的圆底烧瓶中加入100ml浓度为1mm的氯金酸；加热至刚好沸腾状态后，在剧烈搅拌的条件下，立即将10ml浓度为38.8mm柠檬酸钠溶液快速地加入，反应10min后，可观察到溶液的颜色逐步由浅黄色变为黑色、紫色，最后变成酒红色；此时，停止加热，并持续搅拌15min，待自然冷却至室温后，用微孔滤膜过滤，即得到胶体金，4℃冷藏备用；
[0131]
3.偶联方法如下：
[0132]
a.将活化好的噬菌体vpp1原液离心，去除上液，再用无菌水进行重悬，并用微孔滤膜过滤得到高滴度的噬菌体vpp1原液，4℃冷藏备用。
[0133]
b.将制备好的胶体金颗粒溶液的ph值调至5.5～8.5，加入噬菌体vpp1原液结合35min；离心去上清液，用等体积超纯水重悬金纳米颗粒沉淀物，即得到副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物phage-aunps。
[0134]
实施例6上述试剂盒快速检测副溶血性弧菌比色法条件的优化和比色法
[0135]
1.胶体金对宿主菌活性影响测定
[0136]
将制备好的胶体金的ph值用0.1mol/l hci和0.1mol/l k2co3调至7.5，再加入活化好的副溶血性弧菌atcc 33846，放入37℃、160r/min的恒温摇床分别孵育不同时间(5～50min)后，用稀释涂布平板法测定宿主菌的活性变化，同时用pbs溶液作为空白对照组。
[0137]
结果如图10所示，从5～35min宿主菌的活性基本上无太大变化，35min之后宿主菌活性明显下降，但是由于35min已经完成结合，所以胶体金环境对宿主菌的活性无太大影响，不会对检测结果造成较大影响。
[0138]
2.phage-aunps与宿主菌孵育时间的优化
[0139]
将制备好的胶体金的ph值用0.1mol/l hci和0.1mol/l k2co3调至7.5，加入22μl的噬菌体vpp1(10
10
pfu/ml)并结合35min，再加入活化好的宿主菌atcc 33846，放入37℃、160r/min的恒温摇床分别孵育不同时间(5～60min)后，加入10μl 2.1m nacl，5min后观察颜色变化，并用紫外分光光度计表征其紫外吸收光谱图，记录520nm和660nm处的吸光值。
[0140]
结果如图11所示，随着时间的增加，吸光度a
660
/a
520
比值在上升，大量噬菌体特异
33846溶液；
[0154]
2)将副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物phage-aunps分别加入不同浓度的副溶血性弧菌atcc 33846溶液中混合，孵育35min后分别加入10μl不同浓度的nacl，观察颜色变化，并置于紫外分光光度计中检测，分别记录520nm和660nm处的吸光值，分析吸光度a
660
/a
520
比值变化，建立以菌液浓度为横坐标，吸光度a
660
/a
520
比值为纵坐标的标准曲线；
[0155]
3)将待检测样品与副溶血性弧菌噬菌体胶体金偶联物phage-aunps混合，孵育35min后分别加入10μl不同浓度的nacl，观察颜色变化，检测记录520nm和660nm处的吸光值，分析吸光度a
660
/a
520
比值，根据上述标准曲线，得到该待检测样品中副溶血性弧菌的含量。
[0156]
实施例7试剂盒在人工污染湖水中的应用
[0157]
1.湖水样品的预处理
[0158]
湖水样品的准备：在南湖中取100ml湖水中，121℃高温高压灭菌15min，备用。接种副溶血性弧菌atcc 33846制备不同程度污染的1ml湖水样品中，模拟受到不同程度污染的湖水样品，涡旋混匀，在对照组湖水中加入等体积的pbs缓冲液。
[0159]
2.对人工污染湖水的检测
[0160]
将制备好的胶体金ph值用0.1mol/l hci和0.1mol/l k2co3调至7.5，加入22μl的噬菌体vpp1(10
10
pfu/ml)并结合35min，分别加入制备的湖水样品，放入37℃、160r/min的恒温摇床分别孵育30min后，加入10μl 2.1m nacl，5min后观察颜色变化，并用紫外分光光度计表征其紫外吸收光谱图，记录520nm和660nm处的吸光值和吸光度a
660
/a
520
比值。实验重复2次，每次设2个平行。
[0161]
结果如表2，试剂盒的比色法检测结果与平板计数法检测结果没有显著差异性，回收率为77.42％～123.72％，证明噬菌体介导胶体金聚集的可视化检测方法可用于检测湖水样品中的副溶血性弧菌。
[0162]
表2
[0163]
[0164][0165]
注：被检测物的菌液浓度在8.9
×
101～8.9
×
108cfu/ml范围内才具有线性关系，所测得a
660
/a
520
的比值范围在0.4406～1.0493范围内才具有可靠性。
[0166]
实施例8试剂盒在人工污染小龙虾中的应用
[0167]
1.小龙虾样品的预处理
[0168]
将小龙虾用高压灭菌锅在121℃下灭菌15min，取小龙虾样品，分别在头部和尾部涂满菌液，使之吸附于小龙虾中，模拟受到不同程度污染的小龙虾样品。将加标后的小龙虾样品的头部和尾部用灭菌的研磨棒在超净工作台中捣碎，然后与无菌水混匀。待小龙虾与无菌水充分混匀后，取样品液备用。
[0169]
2.对人工污染小龙虾的检测
[0170]
将制备好的胶体金ph值用0.1mol/l hci和0.1mol/l k2co3调至7.5，加入22μl的噬菌体vpp1(10
10
pfu/ml)并结合35min，将20份小龙虾的样品液加入到制备好的溶液中，放入37℃、160r/min的恒温摇床分别孵育30min后，用紫外分光光度计表征其紫外吸收光谱图，记录520nm和660nm处的吸光值，根据吸光度a
660
/a
520
比值变化。
[0171]
结果如表3，该试剂盒的比色法的检测结果与平板计数法检测结果没有显著差异性，回收率为77.08％～119.35％，证明试剂盒的比色法可用于检测副溶血性弧菌。
[0172]
表3
[0173][0174]
注：被检测物的菌液浓度在8.9
×
101～8.9
×
108cfu/ml范围内才具有线性关系，所测得a
660
/a
520
的比值范围在0.4406～1.0493范围内才具有可靠性。
[0175]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。