一种黄颡鱼肾细胞分离及培养方法与流程

1.本发明涉及生物技术技术领域，具体为一种黄颡鱼肾细胞分离及培养方法。


背景技术：

2.黄颡鱼(pelteobagrus fulvidraco)是鲿科、黄颡鱼属一种常见的杂食性淡水鱼。主要分布于中国珠江、闽江、湘江、长江、黄河、海河、松花江及黑龙江等水系。近年来，黄颡鱼养殖技术日趋成熟，产量逐年升高，其已发展为一种淡水名特优水产养殖品种。然而，在水产业快速发展的同时，黄颡鱼养殖养殖规模和养殖密度逐步扩大，同时饲料营养不均衡，最终导致黄颡鱼各种病害频发。因此，对黄颡鱼的基础研究有利于其养殖业的健康快速发展。然而，在对黄颡鱼基础研究方面，有关其原代肾细胞分离及培养仍没有突破。
3.关于鱼类细胞层面的研究，国内外取得了很大的研究进展。1962年由wolf 和quimby建立了世界上第一个鱼类细胞系—虹鳟性腺细胞系(rgt-2)，逐渐地，胖头鱼肌肉细胞系、罗非鱼肾细胞系、乌鳢肾细胞系、大菱鲆肌肉细胞系、剑尾鱼胚胎细胞系swt、大西洋鳟内脏组织细胞系as和巴拉圭鲹幼鱼细胞系等多种包括海淡水鱼类细胞系也陆续建立起来。细胞系的建立前提是原代细胞的分离及培养，同时鱼类原代细胞培养是模拟鱼类活体状态的最佳模型，其已广泛应用于病原学、营养学、药理学、生理学、细胞生物学和环境毒理学等各方面。目前，关于黄颡鱼原代肾细胞的分离和培养还未见到公开发表的专利和论文。已有文献报道，部分淡水鱼原代细胞的分离和培养仅参考哺乳动物细胞的分离及培养方法，但不能完全适用，同时，不同鱼类及不同组织分离的细胞培养条件均不尽相同，导致分离的细胞不稳定，成功率低。因此，建立一种可靠的，可行性高的黄颡鱼原代肾细胞分离及培养方法有助于对黄颡鱼基因功能的进一步研究。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种黄颡鱼肾细胞分离及培养方法，具备肾细胞分离效果好，得到细胞多，而且培养过程中细胞生长良好等优点，解决了黄颡鱼神细胞分离和培养困难的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述肾细胞分离效果好，得到细胞多，而且培养过程中细胞生长良好目的，本发明提供如下技术方案：一种黄颡鱼原代肾细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
8.(1)选取黄颡鱼幼鱼，鱼体消毒后，在超净台无菌解剖迅速取其肾脏，立即置于含青霉素-链霉素-庆大霉素三抗溶液的pbs中清洗；
9.(2)将清洗好的肾脏置于含青霉素-链霉素-庆大霉素三抗溶液的培养基中浸泡，剪碎；
10.(3)将剪碎的肾脏利用胶原酶ⅰ和胰酶消化液混合液消化，收集悬浊液，过滤，离心，吸弃血细胞，加入完全培养基重悬沉淀得细胞悬液，再离心得细胞沉淀
11.(4)向沉淀中加入足量完全培养基，充分重悬混匀，将重悬混匀液分装至25cm2细胞培养瓶中，置于28℃进行培养。
12.优选的，所述步骤(1)中所述黄颡鱼幼鱼，体重约8g，取肾脏组织前饲养在的室内水族缸中，取肾脏前用75％的酒精擦拭鱼体进行消毒。
13.优选的，所述步骤(1)或(2)中所述放置于含青霉素-链霉素-庆大霉素三抗pbs或培养基溶液中青霉素含量为200u/ml，链霉素含量为0.2mg/ml，庆大霉素含量为100μg/ml。
14.优选的，所述步骤(3)中所述胶原酶ⅰ和胰酶混合消化液中胶原酶ⅰ的浓度为2mg/ml，胰酶的浓度为0.25％，加入量为每克肾组织加入5ml混合酶液，28℃消化1.5-2h。
15.优选的，所述步骤(4)中所述完全培养基成分包括：l-15基础培养基、 100u/ml青霉素、20mmol/l hepes、0.1mg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素、 2mmol/l l-谷氨酰胺和20％特级胎牛血清。
16.优选的，所述方法所属全部液体经过0.22μm滤筛进行过滤。
17.优选的，所述方法中，清洗肾脏组织的pbs或培养基中的三抗混合溶液中青霉素、链霉素和庆大霉素的浓度分别是培养基中浓度的二倍，清洗组织的抗生素主要用于杀灭组织上的细菌，培养基中的抗生素主要用于培养细胞过程中抑制细菌生长，由于高浓度的抗生素对细胞的生长生存有不利影响，因此在细胞培养过程中选取合适浓度的抗生素至关重要。
18.(三)有益效果
19.与现有技术相比，本发明提供了一种黄颡鱼肾细胞分离及培养方法，具备以下有益效果：
20.1、该黄颡鱼肾细胞分离及培养方法，通过利用已报道的鱼类及哺乳动物肾细胞分离培养方法进行反复实验，但这些方法对于黄颡鱼肾细胞的分离效果很差，得到的细胞数量少，生存能力弱，很难进行实验研究。基于此，本发明申请人经过数次摸索分离及培养条件，最终提供了本发明技术方案，其解决了黄颡鱼肾细胞分离困难的问题，而且探索出良好的细胞培养方法。这为黄颡鱼相关理论基础的研究奠定了良好的基础，也为其他物种细胞分离培养方法的建立提供参考。
21.相对于现有文献和专利报道的有关鱼类和哺乳类细胞分离和培养技术，本发明建立了黄颡鱼原代肾细胞分离及培养方法，能够解决黄颡鱼神细胞分离和培养困难的问题，并且肾细胞分离效果好，得到细胞多，而且培养过程中细胞生长良好，生理状态稳定，符合原代培养要求。
附图说明
22.图1为本实施例1、对比例1分离的黄颡鱼原代肾细胞培养24h的细胞活力表；
23.图2为本发明的分离的黄颡鱼原代肾细胞；
24.图3为本发明实施例1分离的黄颡鱼原代肾细胞培养72h的细胞形态；
25.图4为本发明实施例1、对比例1分离的黄颡鱼原代肾细胞培养72h的细胞形态。
具体实施方式
26.实施例1
27.一种黄颡鱼肾细胞分离及培养方法具体操作步骤为：
28.(1)选取体重约8g的黄颡鱼幼鱼，饲养在的室内水族缸中，用商品化饲料正常投喂，解剖取肾脏之前，用ms-222(100mg/l水)将鱼进行麻醉，取出幼鱼，用75％酒精擦拭鱼体，剪断鳃弓放血，立即置于无菌超净台进行解剖，在冰上迅速取除肾脏，立即至于含青霉素-链霉素-庆大霉素的三抗(青霉素含量为200u/ml，链霉素含量为0.2mg/ml，庆大霉素含量为100μg/ml) pbs中浸泡并清洗两次，充分去除肾脏上的杂质，得到肾脏组织，如图1所示；
29.(2)将清洗好的肾脏放入事先准备的含青霉素-链霉素-庆大霉素的三抗 (青霉素含量为200u/ml，链霉素含量为0.2mg/ml，庆大霉素含量为100μg/ml) 培养基中，用高温灭菌的眼科剪将组织剪碎成1-2mm3大小，然后将组织碎块连同培养基一同转移至15ml离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，然后向组织碎块中加入胶原酶ⅰ和胰酶混合消化液5ml(胶原酶ⅰ浓度为2mg/ml，胰蛋白酶浓度为0.25％)，28℃恒温消化1.5-2h。
30.(3)向消化的组织悬液加入与酶液等体积的中和培养基(100u/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，50μg/ml庆大霉素，2mmol/l l-谷氨酰胺，10％胎牛血清的l-15培养基)终止消化，将细胞悬液收集在50ml无菌离心管中，过 100目筛网，过滤液收集在新的离心管中，室温1000rpm离心10min，吸弃上清，保留沉淀，用无菌枪头吸弃多余的血细胞，再向肾细胞中加入完全培养基，重悬，1000rpm离心5min，吸弃上清，保留沉淀，再吸弃血细胞，重悬细胞，离心，反复3次，充分纯化以得到纯的肾细胞。
31.(4)根据沉淀大小，向其中加入完全培养基，充分重悬细胞，将细胞分装于25mm2细胞培养瓶中(每瓶分装5ml)，保持细胞密度在105个细胞/ml，倒置显微镜观察细胞形态，如图2所示。从图中可以看出，细胞分散均匀，状态良好，适宜后续培养，观察后置于28℃恒温细胞培养箱中培养。
32.完全培养基成分包括：l-15基础培养基、100u/ml青霉素、20mmol/lhepes、0.1mg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素、2mmol/l l-谷氨酰胺和20％特级胎牛血清，培养基ph在7.6左右。
33.(5)培养24h后，吸弃原培养瓶中的培养液，加入新鲜的完全培养液5ml，继续置于28℃恒温培养箱中培养。
34.(6)培养72h后的黄颡鱼原代肾细胞如图3所示，从图中可以看出绝大多数肾细胞开始贴壁生长，呈现梭形，状态稳定。
35.2.分离的黄颡鱼原代肾细胞活力检测
36.培养24h后，吸取适量的原代肾细胞，加入台盼蓝进行染色(细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以1:1充分混匀)，在3min内，用血球计数板进行细胞计数，同时观察死细胞和活细胞数量(倒置显微镜观察，死细胞被染成深蓝色，而活细胞呈现出无色透明状)，统计细胞活力。
37.活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞数+死细胞数)
×
100％
38.细胞活力检测结果表明，本发明方法分离的黄颡鱼原代肾细胞，活细胞率在90％以上，如图4所示，细胞生长良好，形态完整，已达到原代细胞培养要求，说明本发明技术方案可行。
39.对实施例1的补充说明，在基本实验技术方案相同的基础上，调整部分实验参数进
行如下实验，肾脏组织消化时选取ⅰ型胶原酶浓度为2mg/ml，胰蛋白酶浓度为0.1％，消化条件为28℃消化3h，完全培养基为含20％特级胎牛血清的l-15培养基。结果显示，与实施例1结果基本相同，细胞分散良好， 0.4％台盼蓝染色观察，细胞活力达到85％以上，说明此方案选取条件可行。
40.对比例1一种黄颡鱼原代肾细胞分离
41.与实施例1基本相同，不同之处仅在于鱼体大小差异，实施方案如下：
42.选取体重约100g的黄颡鱼。
43.培养24h，通过0.4％台盼蓝染色观察的细胞，统计结果显示，细胞活力较低，仅有60％左右，如图4所示。培养72h，倒置显微镜观察可见细胞多数聚团，贴壁细胞数量较少，细胞分散不均匀，而且大部分细胞变形，如图4b 所示。说明幼鱼肾脏组织可以显著增强细胞分离效果，而且有较强的细胞活力，同时也说明本发明实施例1的技术方案选取条件可靠。
44.综上所述，该黄颡鱼肾细胞分离及培养方法，通过利用已报道的鱼类及哺乳动物肾细胞分离培养方法进行反复实验，但这些方法对于黄颡鱼肾细胞的分离效果很差，得到的细胞数量少，生存能力弱，很难进行实验研究。基于此，本发明申请人经过数次摸索分离及培养条件，最终提供了本发明技术方案，其解决了黄颡鱼肾细胞分离困难的问题，而且探索出良好的细胞培养方法。这为黄颡鱼相关理论基础的研究奠定了良好的基础，也为其他物种细胞分离培养方法的建立提供参考。
45.相对于现有文献和专利报道的有关鱼类和哺乳类细胞分离和培养技术，本发明建立了黄颡鱼原代肾细胞分离及培养方法，能够解决黄颡鱼神细胞分离和培养困难的问题，并且肾细胞分离效果好，得到细胞多，而且培养过程中细胞生长良好，生理状态稳定，符合原代培养要求。
46.需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
47.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。