复合微生态制剂在制备修复仔猪断奶应激引起的肠道损伤制剂中的应用的制作方法

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1.本发明属于家畜饲养领域，具体涉及复合微生态制剂在制备修复仔猪断奶应激引起的肠道损伤制剂中的应用。


背景技术：

2.仔猪养殖是生猪养殖中至关重要的环节，仔猪阶段的饲养与管理直接影响生猪的出栏时间、出栏率、出栏重等指标，从而影响生猪养殖的生产效益。随着养猪现代化水平的不断提高，目前国内外养殖场通过缩短仔猪断奶日龄(从35-42日龄降低至21-28日龄甚至更早的断奶日龄)提高母猪的年产胎次和繁殖效率，同时仔猪早期断奶可以提高分娩舍利用率、猪群健康水平和节省种猪饲料。但仔猪在早期断奶时期自身消化系统和免疫功能尚未成熟，会导致仔猪出现腹泻、肠道菌群紊乱、肠道结构和功能及肠道屏障受损，免疫力降低、增重缓慢、死亡率升高等断奶应激问题，给养殖企业造成巨大的经济损失。现仔猪断奶应激主要通过添加抗生素、高剂量微量元素等进行调控，在缓解仔猪断奶应激、降低腹泻的同时，也带来了畜产品抗生素残留、肠道微生态失调以及病原菌耐药性增加等问题，并严重的污染了养殖环境，对人类健康构成了严重的威胁。因此，调控仔猪肠道健康缓解断奶应激、提高营养物质消化率，寻找环保有效的抗生素替代品对畜牧业绿色、健康发展，降低细菌耐药性，具有重要作用。
3.肠道微生物在调控动物营养物质消化、肠道屏障、免疫应答及内分泌等多种生理过程中发挥重要作用，肠道菌群失调易位会引起肠细胞凋亡、肠道物理屏障受损及肠道免疫功能紊乱，进而动物生长发育迟缓、腹泻甚至死亡。体内和体外试验研究表明，微生物制剂可通过多种不同的机制抑制有害菌，包括占位和竞争营养物质，直接抑制特定病原微生物，产生细菌素、多肽等直接抑菌化合物，产生短链脂肪酸、降低肠道ph，调节免疫反应和调控肠上皮基因表达如黏蛋白等，免受有害微生物侵害。仔猪断奶应激尤为突出的问题是严重的引起肠道结构和功能、肠道屏障受损，引发肠炎，导致仔猪腹泻，严重会导致死亡。本发明针对仔猪断奶应激引起的肠道损伤问题，筛选了具有修复仔猪断奶应激引起的肠道损伤的功能菌株，通过发酵工艺优化，制备一种修复仔猪断奶应激引起的肠道损伤的复合微生态制剂用于断奶仔猪养殖，通过调控仔猪肠道菌群结构及肠道代谢物，修复仔猪断奶应激引起的肠道损伤，解决当前仔猪断奶应激阶段养殖所面临的仔猪腹泻、死亡率高等问题，替代养殖中抗生素的使用，促进生猪养殖业的绿色健康可持续发展。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供复合微生态制剂在制备修复仔猪断奶应激引起的肠道损伤制剂中的应用。本发明的复合微生态制剂能通过调控仔猪肠道菌群结构及肠道代谢物，修复仔猪断奶应激引起的肠道损伤，解决当前仔猪断奶应激阶段养殖所面临的仔猪腹泻、死亡率高等问题，替代养殖中抗生素的使用，促进生猪养殖业的绿色健康可持续发展。
5.因此，本发明提供了复合微生态制剂在制备修复仔猪断奶应激引起的肠道损伤制剂中的应用，所述的复合微生态制剂，包括罗伊氏乳杆菌，丁酸梭菌和加氏乳杆菌。
6.优选，所述的复合微生态制剂是将罗伊氏乳杆菌菌液、丁酸梭菌菌液、加氏乳杆菌菌液按照体积比300-600：200-400：100-300混合而成。
7.优选，所述的罗伊氏乳杆菌菌液，其活菌数≥1.0
×
109cfu/ml；丁酸梭菌菌液，其活菌数≥5.0
×
108cfu/ml；加氏乳杆菌菌液，其活菌数≥1.0
×
109cfu/ml。
8.优选，所述的复合微生态制剂中包括罗伊氏乳杆菌(1.0～1.8)
×
109cfu/ml、丁酸梭菌(4.0～6.0)
×
108cfu/ml和加氏乳杆菌(1.0～1.8)
×
109cfu/ml。
9.优选，所述的加氏乳杆菌是通过以下方法制备的：
10.将加氏乳杆菌种子液以体积比3-8％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度30
±
1℃，密闭静置培养，发酵时间20-24h，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵，由此制备得到加氏乳杆菌；
11.所述的二级发酵培养基是每升含有糖蜜20g、硝酸铵5g、牛肉膏3g、酵母粉5g、乳糖5g、氯化钠5g，ph6.8。
12.优选，所述的罗伊氏乳杆菌是通过以下方法制备的：
13.将罗伊氏乳杆菌种子液以体积比3-6％的接种量转接到含有产甘油脱水酶发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50-65％，发酵温度28-32℃，微氧培养，转速80-100rpm，用naoh调节ph，控制整个发酵产酶ph5.5-7.0，发酵时间18-25h后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油到菌液中，甘油溶液和菌液体积比：1-5∶99-95，酶转化温度：28-32℃，时间1-5h，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵，由此制备得到罗伊氏乳杆菌；
14.所述的产甘油脱水酶发酵培养基为每升含有糖蜜25g、牛肉膏4g、酵母粉4g，ph 6.0。
15.优选，所述的丁酸梭菌是通过以下方法制备的：
16.将丁酸梭菌种子液以体积比3-8％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度37
±
1℃，密闭静置培养，发酵时间40-52h，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵，由此制备得到丁酸梭菌；
17.所述的二级发酵培养基为每升含有蛋白胨3g、酵母浸粉20g、葡萄糖5g、可溶性淀粉8g、氯化钠5g、七水硫酸镁0.2g、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g、一水硫酸锰0.2g，ph7.0
±
0.2。
18.本发明的复合微生态制剂，其包含加氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和丁酸梭菌，通过饮水、拌料或喷涂饲料等不同方式饲喂断奶仔猪，可在断奶仔猪肠道内定植，调控肠道微生物菌群结构及肠道代谢物，抑制有害菌，产生的微生物次生代谢产物丁酸可提高饲料消化利用率、菌素可修复肠道黏膜损伤，提高仔猪免疫力，解决当前断奶仔猪养殖所面临的仔猪腹泻、死亡率高、断奶体重低等问题，满足生猪健康养殖可持续发展的迫切需要。
19.与现有的技术相比，本发明的具有以下优点：
20.(1)本发明发现，将罗伊氏乳杆菌、丁酸梭菌和加氏乳杆菌复合使用，比单一菌剂效果要好，因加氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和丁酸梭菌发挥不同功效。
21.(2)相比使用抗生素等传统方法，使用修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微
生态制剂可修复肠道黏膜损伤，提高仔猪免疫力，可降低断奶仔猪的腹泻和死亡率，提高饲料消化利用率。
22.(3)本发明修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂属于绿色环保动物微生物制剂。
具体实施方式：
23.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
24.一、修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的加氏乳杆菌的制备方法
25.1菌种活化
26.首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种加氏乳杆菌，划线接种到改良mrs琼脂试管斜面，30℃培养22-28h；然后转接到改良mrs液体培养基中，30℃静置培养24-30h，形成三角瓶液体菌种。
27.2扩大培养
28.2.1一级扩大培养
29.三角瓶液体菌种以体积比3-6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的30l种子罐中，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度30
±
1℃，密闭静置培养，发酵时间为18-24h，制成一级种子液。
30.2.2二级扩大培养
31.将一级种子液以体积比3-8％的接种量转接到含有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度30
±
1℃，密闭静置培养，发酵时间20-24h，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵。由此制备得到加氏乳杆菌液体微生物制剂。
32.3培养基
33.3.1所述的改良mrs液体培养基，一级发酵培养基均为：在1l的体系里面：将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，加水至1000ml，ph6.8；115℃灭菌30min。琼脂培养基是加入20g/l的琼脂。
34.3.2所述的二级发酵培养基为：在1l的体系里面：将糖蜜20g、硝酸铵5g、牛肉膏3g、酵母粉5g、乳糖5g、氯化钠5g，加水至1000ml，ph6.8；115℃灭菌30min。
35.二、修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的罗伊氏乳杆菌的制备方法
36.1菌种活化
37.首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种罗伊氏乳杆菌，划线接种到mrs琼脂试管斜面，37℃培养24-28h；然后转接到mrs液体培养基中，37℃静置培养20-30h，形成三角瓶液体菌种。
38.2扩大培养
39.2.1一级扩大培养
40.三角瓶液体菌种以体积比3-6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的30l种子罐中，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度37
±
1℃，密闭静置培养，发酵时间为16-20h，制成一级种子液；
41.2.2二级扩大培养
42.将一级种子液以体积比3-6％的接种量转接到含有产甘油脱水酶发酵培养基中进行发酵，发酵罐装液量为50-65％，发酵温度28-32℃，微氧培养，转速80-100rpm，用6mol/lnaoh调节ph，控制整个发酵产酶ph5.5-7.0，发酵时间18-25h后，以变速流加的方式流加已灭菌冷却的甘油(甘油浓度150-450mmol/l)到菌液中，甘油溶液和菌液体积比：1-5∶99-95，酶转化温度：28-32℃，时间1-5h。检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵。由此制备得到罗伊氏乳杆菌液体微生物制剂。
43.3培养基
44.3.1所述的mrs液体培养基，一级发酵培养基均为：在1l的体系里面：将蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二胺2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温801ml、碳酸钙10g，加水至1000ml，ph6.8；115℃灭菌30min。琼脂培养基是加入20g/l的琼脂。
45.3.2所述的产甘油脱水酶发酵培养基为：在1l的体系里面：将糖蜜25g、牛肉膏4g、酵母粉4g，ph 6.0加水至1000ml，115℃灭菌30min。
46.三修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的丁酸梭菌的制备方法
47.1菌种活化
48.首先制菌种，无菌开启冻干保藏菌种丁酸梭菌，划线接种到rcm琼脂试管斜面，37℃厌氧培养18-24h；然后转接到rcm液体培养基中，37℃厌氧静置培养20-28h，形成三角瓶液体菌种。
49.2扩大培养
50.2.1一级扩大培养
51.三角瓶液体菌种以体积比3-6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的30l种子罐中，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度37
±
1℃，密闭静置培养，发酵时间为18-24h，制成一级种子液。
52.2.2二级扩大培养
53.将一级种子液以体积比3-8％的接种量转接到含有二级发酵培养基的300l发酵罐中进行二级发酵，发酵罐装液量为70-80％，发酵温度37
±
1℃，密闭静置培养，发酵时间40-52h，检测ph降低至4.0-4.5而且不再变化时，即可以结束发酵。由此制备得到丁酸梭菌液体微生物制剂。
54.3培养基
55.3.1所述的rcm培养基，一级发酵培养基均为：在1l的体系里面将
[0056][0057][0058]
加水至1000ml，ph7.0
±
0.2；115℃灭菌30min。
[0059]
琼脂培养基是加入20g/l的琼脂。
[0060]
3.2所述的二级发酵培养基为：在1l的体系里面将
[0061][0062]
加水至1000ml，ph7.0
±
0.2；115℃灭菌30min
[0063]
四修复仔猪断奶应激引起肠道损伤三种功能菌剂(罗伊氏乳杆菌、丁酸梭菌和加氏乳杆菌)优化组合为，以1l计：
[0064]
罗伊氏乳杆菌300-600ml(活菌数≥1.0
×
109cfu/ml)，丁酸梭菌200-400ml(活菌数≥5.0
×
108cfu/ml)和加氏乳杆菌100-300ml(活菌数≥1.0
×
109cfu/ml)。
[0065]
以下实施例是分别将上述罗伊氏乳杆菌、丁酸梭菌和加氏乳杆菌液体微生物制剂用其二级扩大培养时用的培养基进行调节或者浓缩，使其浓度满足要求。
[0066]
实施例1：
[0067]
修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂制备方法如下：
[0068]
以1l计：将罗伊氏乳杆菌、丁酸梭菌和加氏乳杆菌液体微生物制剂分别为500ml、300ml、200ml混合即得修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂，其总活菌数为3.1
×
109cfu/ml。
[0069]
养殖试验：
[0070][0071]
将罗伊氏乳杆菌液体微生物制剂、丁酸梭菌液体微生物制剂和加氏乳杆菌液体微生物制剂及本发明制备的复合微生态制剂按质量比1％的比例均匀喷涂在断奶仔猪基础饲
料上饲喂断奶仔猪，各组实验条件一致，每个组10头断奶仔猪。
[0072]
经21d养殖试验，结果显示：与ctr0相比(ctr0组腹泻率25.89％，病死率14.08％，十二指肠绒毛高度398.11μm，隐窝深度234.54μm，空肠绒毛高度487.14μm，隐窝深度198.78μm，回肠绒毛高度239.56μm，隐窝深度165.60μm)，试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ饲喂添加微生态制剂的试验组断奶仔猪的腹泻率分别比对照组降低了39.35％、42.16％、46.10％和89.797％，病死率分别比ctr0降低了38.12％、32.04％、40.33％和71.27％，十二指肠绒毛高度分别比ctr0提高了12.95％、9.12％、11.97％和37.99％，十二指肠的隐窝深度分别比ctr0降低了15.08％、14.96％、15.78％和28.30％，空肠绒毛高度分别比ctr0提高了13.62％、10.26％、9.66％和31.03％，空肠的隐窝深度分别比ctr0降低了13.95％、11.64％、12.55％和27.10％。结果表明：添加修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂可降低断奶仔猪的腹泻率，提高断奶仔猪的成活率，对肠道结构的损伤有明显的修复作用，且本发明复合微生物制剂其效果优于单一菌剂效果。
[0073]
实施例2：
[0074]
修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂制备方法如下：
[0075]
以1l计：将罗伊氏乳杆菌、丁酸梭菌和加氏乳杆菌液体微生物制剂分别为300ml、400ml、300ml混合而成即制得修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂，其总活菌数2.6
×
109cfu/ml。
[0076]
养殖试验：
[0077][0078]
将罗伊氏乳杆菌液体微生物制剂、丁酸梭菌液体微生物制剂和加氏乳杆菌液体微生物制剂及本发明制备的复合微生态制剂按质量比1％的比例均匀喷涂在断奶仔猪基础饲料上饲喂断奶仔猪，各组实验条件一致，每个组10头断奶仔猪。
[0079]
经21d养殖试验，结果显示：与ctr0相比(ctr0组腹泻率23.77％，病死率13.19％，肠粘膜促炎性因子il-1β含量3709.41pg/g，il-2含量423.78pg/g，il-6含量291.15pg/g，il-10含量149.36pg/g)，试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ饲喂添加微生态制剂的试验组断奶仔猪的腹泻率分别比对照组降低了51.78％、48.61％、49.33％和81.43％，病死率分别比ctr0降低了
48.17％、41.88％、45.03％和83.25％，肠粘膜促炎性因子il-1β含量分别比对照组降低了23.81％、28.57％、19.05％和47.62％，il-2含量分别比对照组降低了18.62、15.58％、16.35％和44.55％，il-6含量分别比对照组降低了23.03％、11.66％、24.35和59.10％，肠粘膜抗炎性因子il-10含量分别比对照组提高了27.30％、19.33％、20.55％和75.15％。结果表明：添加修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂可降低断奶仔猪的腹泻率，提高断奶仔猪的成活率，对肠粘膜的损伤有明显的修复作用，且本发明复合微生物制剂其效果优于单一菌剂效果。
[0080]
实施例3：
[0081]
修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂制备方法如下：
[0082]
以1l计：将罗伊氏乳杆菌、丁酸梭菌和加氏乳杆菌微生物制剂分别为600ml、200ml、200ml混合而成即制得修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂，其总活菌数4.2
×
109cfu/ml。
[0083]
养殖试验：
[0084][0085][0086]
将罗伊氏乳杆菌液体微生物制剂、丁酸梭菌液体微生物制剂和加氏乳杆菌液体微生物制剂及本发明制备的复合微生态制剂按质量比1％的比例均匀喷涂在断奶仔猪基础饲料上饲喂断奶仔猪，各组实验条件一致，每个组10头断奶仔猪。
[0087]
经21d养殖试验，结果显示：与ctr0相比(ctr0组腹泻率24.11％，病死率13.68％，日增重率14.57％，空肠粘膜二胺氧化酶活性171.82u/kg，回肠粘膜二胺氧化酶活性62.63u/kg)，试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ饲喂添加微生态制剂的试验组断奶仔猪的腹泻率分别比对照组降低了51.83％、48.93％、49.48％和85.71％，病死率分别比ctr0降低了46.77％、44.78％、48.76％和81.59％，日增重率分别比ctr0提高了35.31％、38.63％、41.05％和71.21％，空肠粘膜二胺氧化酶活性分别比ctr0降低了42.03％、43.91％、44.28％和70.21％，回肠粘膜二胺氧化酶活性分别比ctr0降低了43.93％、46.51％、42.74％和70.17％。结果表明：添加修复仔猪断奶应激引起肠道损伤的复合微生态制剂可降低断奶仔猪的腹泻率，提高断奶仔猪日增重和成活率，对肠粘膜的损伤有明显的修复作用，且本发明
复合微生物制剂其效果优于单一菌剂效果。