一种鉴定桃花型性状的dCAPs分子标记及其应用

一种鉴定桃花型性状的dcaps分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定桃花型性状的dcaps分子标记及其应用。


背景技术：

2.桃(prunus persica)属于蔷薇科(rosaceae)李属(prunus)，不仅果实营养丰富，还具有重要的观赏价值。桃花型分为铃形(non-showy)和蔷薇形(showy)，受一对等位基因sh/sh控制，铃形(sh)对蔷薇形(sh)为显性。位于chr8上的ppb3-1基因是花型的候选基因，参与花瓣发育，促进花瓣增大，ppb3-1启动子区域的snp与桃的花型性状高度相关。
3.马瑞娟等对507个栽培桃资源花型进行调查分析，发现铃型花资源79个，占15.6％，蔷薇型花资源428个，占比84.4％，说明栽培桃品种以蔷薇型花为主。 chaparro等通过9个f2分离群体对桃花型性状的遗传规律进行分析，f2后代中铃型花与蔷薇型花的分离比为3∶1，符合孟德尔遗传规律，为质量性状。fan等将该性状作为一个形态学标记锁定在桃第8号连锁群上，位于标记cppt006与 pacc13之间。micheletti等对1580份桃种质资源进行gwas分析，发现位于第 8号连锁群上有18个snp标记与花型性状紧密相关，范围为4.3mb。随后cao 等利用gwas分析发现位于第8号连锁群13,740,117 bp处存在一个与花型性状关联度较高的snp位点。本团队对
‘
黄水蜜’(sh)和
‘
中油桃14号’(sh)f1杂交群体后代进行gwas分析，发现位于ppb3-1基因启动子区域的一个snp关联度最高，并通过测序发现该snp位点与花型性状共分离，且 ppb3-1(pp08g015510)基因在不同花型的花瓣中差异表达，将ppb3-1基因确定为桃花型性状候选基因。
4.目前，在公开号为cn 107893125 a的中国发明专利中，公开了一种用于鉴定桃花铃型/蔷薇型性状的单核苷酸多态性标记位点，利用snp分子标记将桃花铃型/蔷薇型性状进行区分，虽然区分度能够平均达到95.99％，但是从公开的内容来看，对有些品种的预测准确率为90％，也就是说有可能预测失败，这样就对于一些难以区分的品种进行细分存在一定的问题。同时，cn 107893125 a的中国发明专利中需要进行测序，且成本较高，本专利采用的是dcaps标记，pcr产物经过酶切后，利用聚丙烯安凝胶电泳就可以进行检测，成本较低。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鉴定桃花型性状的dcaps分子标记，该标记鉴定铃型/蔷薇型的准确率为100％。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
7.一种鉴定桃花型性状的dcaps分子标记，其特征在于，扩增所述分子标记的引物对的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2 所示，所述花型包括铃型、蔷薇型。
8.上述dcaps分子标记在鉴定或辅助鉴定桃花铃型/蔷薇型性状以及辅助选择育种
方面中的应用。
9.另外，包含上述引物对的试剂盒，可以用来鉴定桃花型性状，具体应用时，可以选择含有上述分子标记引物对的试剂做成试剂盒。
10.利用本发明的分子标记，可以对桃花型基因进行定位，上述这些应用均可以按照常规的方法进行。
11.其中，利用上述分子标记引对鉴定桃花型性状的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
12.(1)提取待测桃基因组dna；
13.(2)以步骤(1)中所提取基因组dna为模板，利用所述分子标记的引物对进行pcr扩增；
14.(3)对步骤(2)中的扩增产物进行酶切处理，之后进行电泳检测；
15.(4)根据步骤(3)的电泳条带结果进行判定，具体标准为：
16.如果酶切产物为长度308bp的特征条带(序列如seq id no.3所示)，则待测桃为蔷薇型，如果酶切扩增产物为282bp的特征条带(序列如seq id no.4 所示)，该待测桃为纯合铃型，如果酶切产物为两条长度分别为308bp、282bp 的特征条带，该待测桃为杂合铃型。
17.本发明的优点：
18.本发明通过在突变位点附近引入错配碱基而衍生出dcaps标记，该标记具有共显性、位点特异、操作简单和成本低等优点，在品种分类和分子标记辅助育种中得到了广泛的应用。开发的dcaps标记，在突变碱基处通过引入错配碱基 g，获得sali-hf限制性内切酶位点，可对自然群体不同花型资源进行准确鉴定，准确率100％。通过开发的与花型性状相关的dcaps标记，在表型与基因型验证中一致，可以作为一个分子标记，在辅助选择育种中进行应用，对初步筛选不同花型桃种质资源具有重要的科学意义和经济价值。
附图说明
19.图1是dcaps标记b3-1引物设计；
20.图2是两种花型snp位点的三种类型；图中，a.花型snp位点三种变异类型：
21.a/a：蔷薇型纯合基因型；a/c铃型杂合基因型；c/c铃型纯合基因型；
22.图3是dcaps标记pcr扩增结果(上图)以及sali-hf酶切结果(下图)；
23.图4是dcaps标记对桃铃型/蔷薇型花杂交群体的酶切结果；图中，p1：母本； p2：父本；1-86：杂种后代；
24.图5是dcaps标记对桃铃型/蔷薇型花自然群体的酶切结果。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
26.若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。
27.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
28.一、实验材料
29.共收集185个桃花瓣材料(112个自然群体和73个f1杂交后代)，包括117 个蔷薇形花、63个铃形花。花瓣材料用于进行基因组dna的提取，所有材料从树体上取下后立即液氮冷冻，并保存在-80℃备用。
30.二、实验方法
31.1桃花瓣基因组dna的提取
32.利用液氮研磨桃花瓣至粉末状，确保研磨充分并且不受氧化。使用dna提取试剂盒(购买于北京诺贝莱生物科技有限公司)提取花瓣材料的dna。用1.2％的琼脂糖凝胶进行质量检测，确保提取dna条带清晰可见，不存在降解。利用 nanodrop 2000(thermo scientific)微量紫外分光光度计检测dna浓度，以保证后续使用。
33.2花型性状dcaps标记b3-1开发、扩增及检测
34.利用在线软件dcaps finder 2.0(http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计上游引物，primer primer 5.0软件设计下游引物，根据snp位点处碱基的差异，在特异性扩增引物f端引入可以使用sali-hf限制性内切酶进行酶切的错配碱基 g，得到用于dcaps标记b3-1开发的正向引物为b3-1-f： 5
’‑
atatacgtgtacaatagatagtcga-3’(seq id no.1)，反向引物为b3-1-r：5
’‑
atactttcctatgatcgtagtttct-3’(seq id no.2)(图1)。
35.利用上述分子标记特异性引物对不同材料进行pcr扩增。pcr反应程序为： 95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸7min；12℃ 30min。对pcr产物进行纯化后，使用限制性核酸内切酶sali-hf进行酶切：1μg pcr纯化产物，0.5μl(20u/μl)sali-hf限制性内切酶，2.5μlcutsmart，补足ddh2o至25μl，37℃酶切5h。然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(8％丙烯酰胺，电压200v，电流130ma，电泳时间1h)对酶切产物进行检测分析。
36.三、实验结果
37.1花型性状dcaps标记b3-1开发及验证
38.利用标记特异性引物进行的pcr扩增，snp位点有三种类型：a/a、a/c 和c/c，杂合snp位点a/c和纯合snp位点c/c为铃型，纯合snp位点a/a 为蔷薇型(图2)。通过对pcr产物进行纯化后，使用限制性核酸内切酶sali-hf 进行酶切。a/a类型的桃种质资源未被切开，产生一条308bp特异片段；a/c类型的桃种质资源被切开，产生308bp和282bp两条特异片段；c/c类型的桃种质资源被切开，产生一条282bp特异片段(图3)。根据基因型和表型在10个品种中利用dcaps标记验证，结果表明dcaps标记能够有效的区分铃型、蔷薇型，准确率为100％(表1)。
39.表1 dcaps标记b3-1在10个桃品种中的验证
[0040][0041]
2dcaps标记b3-1在桃蔷薇型/铃型杂交群体中的应用
[0042]
以
‘
黄水蜜’(蔷薇型花)为母本，
‘
中油桃14号’(铃型花)为父本杂交获得的73株杂种后代，利用dcaps标记对桃铃型/蔷薇型杂交群体进行验证，结果显示所有杂种后代单株出现两种特异片段类型，分别为308bp纯合片段和 308bp与282bp杂合片段(图4)，与在田间调查得到的表型和基于snp基因分型结果一致，符合率为100％(表2)，表明桃花型性状ppb3-1基因dcaps 标记适用于桃铃型/蔷薇型品种育种早期的选择。
[0043]
表2 dcaps标记在桃铃型/蔷薇型花杂交群体中的验证
[0044][0045][0046]
3dcaps标记b3-1在桃自然群体中的应用
[0047]
用于铃型/蔷薇型标记检测的102份自然群体的桃种质资源，包含68份蔷薇型材料，34份铃型材料(表3)。dcaps标记b3-1检测结果如图5所示，铃型花被酶切，产生两种类型特异片段：308bp和282bp两条特异片段(杂合显性，a/c)和282bp一条特异片段(纯合显性，c/c)，蔷薇型花未被酶切，产生一条308bp特异片段(纯合隐性，a/a)。ppb3-1基因dcaps标记在102个自然群体中的验证结果和表型及基于snp基因分型结果完全一致，符合度为100％。
[0048]
表3 dcaps标记在桃铃型/蔷薇型花自然群体中的验证
[0049]
[0050]
[0051][0052]
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。