基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法及其应用与流程

基于芽孢杆菌pha合成酶的功能化微球构建方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，更具体涉及一种基于芽孢杆菌pha合成酶的功能化微球构建方法及其应用。


背景技术：

2.酶作为高效生物催化剂，具备底物特异性好、温和的反应条件和快速的反应速度，在许多领域得到了广泛的应用，如化工制造、食品生产、环境、医药等行业。
3.多数天然酶难以进行大规模的生产制备，投入反应后无法回收再利用并且为后续工艺的纯化除杂造成困难，酶相较传统工业催化剂稳定性较差、对环境变化的敏感度高。为了改善酶的稳定性，使其在工业生产中能够连续使用，将酶负载于固相载体的固定化酶技术得到广泛关注。
4.传统的酶固定化方法主要有吸附法、共价结合法、包埋法、交联法等。包埋法固定化酶的固定过程中，酶本身不受化学反应的影响，能保证酶本身的反应活性在固定化酶制备过程中损失较小并且使用过程中酶不易脱落，但是酶被包裹在固相载体内导致酶与底物的结合范围变小，一定程度上影响了酶活性的发挥。吸附法是目前使用广泛的固定化酶的方法，采用吸附法对酶进行固定化操作简便、固定化过程温和、成本低，但酶与固相载体间结合不牢固极易在使用过程中脱落。交联法及共价结合法将酶与固相载体通过共价键结合，结合牢固但结合过程中的反应条件较为剧烈，会对酶活造成较大的损失。传统的固定化酶手段需要将酶分离提纯后再与制备好的固相载体进行结合，过程复杂，同样限制了固定化酶大规模工业化应用。
5.与传统的固定化酶方式对比，模拟天然多酶复合体，在胞外人工构建多酶分子机器有着诸多优点。由微生物产生的聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoat e，pha)微球，就是一个天然的多酶自组装复合体。其内部是由疏水聚酯链构成的疏水核心，外层是由磷脂界膜及膜上嵌入或附着的包括pha合酶(polyest er synthase，phac)、pha颗粒结合蛋白(granule associated protein，phap)、pha合成调控蛋白(regulator protein，phar)和nadph依赖的乙酰乙酰辅酶a还原酶(nadph dependent acetyl-coa reductase，phab)等构成的多酶边界层。phac通过共价键连接在pha微球表面，而phap通过疏水相互作用吸附在pha微球表面。通过将外源性功能蛋白元件与phac或phap进行融合表达，在重组微生物体内就能直接合成表面带有功能蛋白的微球复合体。通过调控phap基因的表达，即可获得不同颗粒大小、不同载量酶元件的pha微球。该微球通过细胞破碎及离心等方法就能简便、有效地从细胞中分离并得以纯化，有望成为多酶组装的一种经济高效的替代方法。
6.目前，已有应用该pha微球承载各种单酶进行组装的报道，如新西兰rehm课题组分别将脂肪酶b、β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶或碳酸酐酶与pha合成酶进行融合表达，在重组大肠杆菌中生产出具有酶活的pha固定化单酶的微球。但是尚无pha微球胞内固定化多酶，并将其应用于体外级联催化方面的报道。


技术实现要素：

7.本发明需要解决的技术问题是提供一种基于芽孢杆菌pha合成酶的功能化微球构建方法及其应用，以解决不能pha微球胞内固定化多酶的问题，以实现pha微球的多酶组装。
8.为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
9.一种基于芽孢杆菌pha合成酶的功能化微球构建方法，以bacillus cereus hbl-ai中的phaa、phab、phar，phac和phap基因为起点开始构建，其特征在于，具体包括以下步骤：
10.s1、构建合成pha微球的重组表达质粒：构建重组质粒pacycduet-1 p1 c.n phaab p2 b.c pharc、重组质粒pacycduet-1 p1 c.n phaab p2 b.c pharc-egfp、重组质粒pet28a-phap-mcherry；
11.s2、构建重组菌株并表征：利用s1中制备的重组质粒构建胞内合成pha微球的重组菌株，并通过共聚焦和电镜对合成的pha微球进行表征；
12.s3、构建pha微球自组装羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组质粒系统。
13.进一步优化技术方案，所述s1中构建重组质粒pacycduet-1 p1 c.nphaab p2 b.cpharc的方法为：将来源于bacillus cereus hbl-ai的phaab和pharc基因簇分别插入载体pacycduet-1的mcs-1、mcs-2。
14.进一步优化技术方案，所述基因簇的插入方式为overlap pcr组装。
15.进一步优化技术方案，所述载体pacycduet-1包含2个多克隆位点mcs-1、mcs-2，每个位点前面都有1个t7启动子和lac操纵子以及核糖体结合位点。
16.进一步优化技术方案，所述s1中构建重组质粒pacycduet-1 p1 c.nphaab p2 b.cpharc-egfp的方法为：以pacycduet-1 p1 c.nphaab p2 b.cpharc为pcr模板扩增pharc，以pet-28a(+)&egfp为pcr模板扩增egfp，通过引物引入linker(3*g4s)，使用overlap pcr拼装片段pharc-egfp，酶切后连接至pacycduet-1 p1 c.nphaab的mcs-2。
17.进一步优化技术方案，所述s1中构建重组质粒pet28a-phap-mcherry的方法为：利用引物pcr分别扩增bacillus cereus hbl-ai的phap基因和pet28a-mcherry质粒的mcherry基因，然后采用overlap pcr将目标片段插入到载体pet28a的bamhⅰ和hindⅲ酶切位点处。
18.进一步优化技术方案，所述s2中合成pha微球的重组菌株的过程为：将相同体积的pacycduet-1 p1 c.n phaab p2 b.c pharc-egfp和pet28a-phap-mcherry同时加入到bl21(de3)感受态细胞中，冰浴、热激、冰浴；随后向感受态细胞加入lb培养基，37℃200rpm培养1h；将培养液离心后，取沉淀悬液涂布于lb琼脂板上，37℃过夜培养；次日，从平板上提取菌斑加至含有相应抗生素的lb培养基中，培养至od值为0.8，取出部分菌液，加入同体积的甘油，冻存；剩余菌液加入终浓度1mm iptg，诱导48h得到重组菌株。
19.进一步优化技术方案，所述s3的具体操作为：将步骤s2制得的重组大肠杆菌3振荡培养过夜，按1％接种量将种子液接种至pet-lac自诱导培养基中，37℃，200rpm振荡培养20h后，6000rpm、10min离心收集菌体，pbs洗涤2次，使用改良m9培养基重悬后转移至100ml改良m9培养基中，37℃，200rpm培养24h得到重组质粒系统。
20.一种基于芽孢杆菌pha合成酶的功能化微球的应用，用于催化托伐普坦前手性酮合成s型托伐普坦；具体步骤包括：
cereus hbl-ai的phap基因和pet28a-mcherry质粒的mcherry基因，然后采用overlap pcr将目标片段插入到载体pet28a的bamhⅰ和hin dⅲ酶切位点处。
38.s2、构建重组菌株并表征：利用s1中制备的重组质粒构建胞内合成pha微球的重组菌株，并通过共聚焦和电镜对合成的pha微球进行表征。将pacy cduet-1 p1 c.n phaab p2 b.c pharc-egfp和pet28a-phap-mcherry各1μl同时加入到bl21(de3)感受态细胞中，4℃冰浴30min、42℃热激90s、4℃冰浴5min。随后向热激后的感受态细胞加入950μl lb培养基，37℃200rpm培养1h。将培养液离心后，取沉淀悬液涂布于含有30mg/l硫酸卡那霉素与100mg/l氯霉素的lb琼脂板上，37℃过夜培养。次日，从平板上提取菌斑加至含有相应抗生素的5ml lb培养基中，37℃200rpm培养至od值为0.8，取出200μl，加入200μl甘油，冻存。剩余菌液加入终浓度1mm iptg，25℃150rpm诱导48h，sds-page分析蛋白表达情况，如图4所示，重组菌株构建成功，可以观察到相应pha微球组成的相关蛋白均可正常表达。
39.s3、构建pha微球自组装羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组质粒系统。将步骤s2制得的重组大肠杆菌37℃，200rpm振荡培养过夜，按1％接种量将种子液接种至100ml pet-lac自诱导培养基中，37℃，200rpm振荡培养20h后6000rpm，10min离心收集菌体，pbs洗涤2次，使用改良m9培养基重悬后转移至100ml改良m9培养基中，37℃，200rpm培养24h。
40.取培养液进行菌体细胞的激光共聚焦显微镜进行观察。剩余菌液用于提取pha微球经冷冻干燥后的菌体在4℃下自然融化，以1:15(m/v)的比例加入菌体裂解缓冲溶液重悬菌体，使用超声波细胞破碎仪破碎菌体，条件为：60％功率、开20s、停60s。菌体裂解液15000rpm，离心15min，弃上清，使用菌体裂解缓冲溶液洗涤沉淀2次，使用包涵体洗涤缓冲溶液洗涤沉淀2次，最后重悬沉淀添加甘油至终浓度为50％，-80℃保存。将保存于-80℃的pha微球悬液置于流水下解冻，稀释悬液，将稀释过的pha微球悬液滴加在5
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5mm的硅片表面，置于45℃恒温干燥箱内烘干。烘干后在硅片表面滴加1％磷钨酸水溶液(固定表面结合蛋白)，复染2min后用滤纸吸干表面液体，滴加去离子水洗去表面多余的磷钨酸，洗涤3次后置于45℃恒温干燥箱内烘干，使用扫描电子显微镜观察微球形貌。
41.实验结果：
42.菌体细胞在共聚焦显微镜下能够观察到mcherry的红色荧光与egfp的绿色荧光，红色荧光与绿色荧光可以重叠，说明融合蛋白phac-egfp和phap-mcherry能够结合在pha微球表面。
43.制备样品通过透射电镜对其胞内pha积累状况进行观察，如图5所示，工程菌胞内积累有大量直径100-200nm的pha微球。
44.使用扫描电镜观察提取到的pha微球，如图6所示，胞内pha微球直径约为100-200nm；微球表面粗糙，推测是由于微球表面存在表面结合蛋白所造成的。
45.由此验证我们所构建的重组大肠杆菌可以在胞内通过phac蛋白和phap蛋白将功能化绿色荧光蛋白egfp和红色荧光蛋白mcherry展示于pha微球表面，为该pha微球进行具体催化活性的功能蛋白的组装打下基础。
46.本发明中基于芽孢杆菌pha合成酶的功能化微球的应用方式为：将pha合成酶的功能化微球用于催化托伐普坦前手性酮合成s型托伐普坦；具体包括以下步骤：
47.a1、构建合成pha微球自组装羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌：以质粒pacycduet-1 p1 c.n phaab p2 b.c pharc-egfp和pet28a-phap-mcherry为模板，利用设
计的无缝克隆的引物扩增质粒骨架部分，同时引物扩增含有催化活性的羰基还原酶psadh(genbank数据库登录号为mg181955)和甲酸脱氢酶cpfdh(genbank数据库登录号为mg181956)的重组质粒。利用连接酶分别对上述扩增片段进行连接，以构建图7所示的质粒pacycduet-1 p1 c.nphaab p2 b.cpharc-cpfdh和pet28a-phap-psadh。利用具有催化活性的psadh和cpfdh基因分别替换egfp和mcherry基因。
48.通过s2相同的方法，将两个重组质粒转化进大肠杆菌表达系统中，构建重组菌株bl21-pha-psadh&cpgdh。重组菌株按1％接种量将种子液接种至100ml pet-lac自诱导培养基中，37℃，200rpm振荡培养20h后6000rpm，10min离心收集菌体，pbs洗涤2次，使用改良m9培养基重悬后转移至100ml改良m9培养基中，37℃，200rpm培养24h。
49.发酵培养结束后6000rpm，10min离心收集菌体，pbs洗涤2次，将离心所得的菌体置于-80℃冷冻过夜。冷冻后的菌体在4℃下自然融化，以1:15(m/v)的比例加入菌体裂解缓冲溶液重悬菌体，使用超声波细胞破碎仪破碎菌体，条件为：60％功率、开20s、停60s。菌体裂解液15000rpm，离心15min，弃上清，使用菌体裂解缓冲溶液洗涤沉淀2次，使用包涵体洗涤缓冲溶液洗涤沉淀2次，最后得到的重悬沉淀即为pha合成酶的功能化微球。
50.a2、将pha合成酶的功能化微球加入催化反应体系，用于催化托伐普坦前手性酮合成s型托伐普坦，并进行hplc检测，研究pha合成酶的功能化微球催化性能。具体操作如下：
51.将4-10mg pha合成酶的功能化微球加入2ml的催化反应体系中，催化反应体系包括nadp+(1.53-3.06mg)，葡萄糖(4-8mg)，前手性酮底物(5-10mg)，ph7.0磷酸缓冲溶液补足到2ml。37℃，150rpm反应12h。反应完毕后取100μl反应液，再加入400μl乙腈，震荡、离心、过膜后进行hplc检测反应。检测结果为首次使用固定化酶的催化能力。
52.反应完毕后，通过离心分离收集pha合成酶的功能化微球，并用缓冲溶液清洗两次，采用相同的反应体系用于后续重复使用性研究。过中使用hplc检测底物和产物的浓度。分析方法如下：分析柱agilent extend c-18(4.6mm
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250mm，5μm)，液相条件为流动相a：含0.05％三氟乙酸水溶液，b：乙腈溶液，紫外检测波长254nm，进样量10μl，流速1ml/min，柱温30℃。梯度洗脱条件为0～14min(60％b)，14％～15min(60％～90％b)，15～20min(90％b)，20min～21min(90％～60％b)，20％～21min(60％b)。记录结果并分析计算多酶复合体的重复使用性。
53.结果表明：
54.经hplc检测pha合成酶的功能化微球可催化合成s型托伐普坦，底物浓度在5-10mg/ml范围时，转化率在95％-98％，e.e.值均达到99％。离心分离回收pha合成酶的功能化微球用于重复使用性研究，结果也表明制备的pha合成酶的功能化微球固定化的羰基还原酶经过10次循环使用后，仍然保持80％以上的酶活。这一结果表明pha合成酶的功能化微球利用价值明显优于游离酶，可循环使用多次，并保持了良好的稳定性。此pha合成酶的功能化微球不仅限于羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的组装，将来可应用于多种级联催化反应过程中的催化酶类。