一种双启动子质粒及其构建方法和应用与流程

1.本技术涉及质粒构建技术领域，尤其涉及一种双启动子质粒、构建方法及其应用，更具体的是，通过所构建的双启动子质粒瘤内表达细胞因子抑制肿瘤生长。


背景技术：

2.载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。主要包括已有载体多克隆位点（mcs）的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。是为把dna分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的dna片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体，载体构建即是构建含外源dna的质粒。
3.现有技术中，利用基因工程制备重组免疫蛋白时，通过应用质粒中cmv promoter（巨细胞病毒启动子）等强启动子的在真核表达系统（如肿瘤细胞）里表达获得相关免疫蛋白，这种方法具有表达量较低、获得的重组蛋白含量少、成本较高等问题。
4.因此，亟需构建一种质粒载体，该质粒载体通过与目标基因精确结合，并载入表达系统，获得更高表达量的目标蛋。


技术实现要素：

5.针对以上技术问题，本技术构思在于，提供一种连续双启动子质粒，优化基因的表达结构，即构建区别于现有技术的重组质粒结构，使其在表达系统中能够更高量地表达目标蛋白。
6.结合以上构思，本技术提供了一种具备双启动子的全新结构的质粒载体，所述质粒载体进入肿瘤细胞后，首先由巨细胞病毒（下简称“cmv”）启动子启动t7 rna聚合酶基因转录，翻译产生的t7 rna聚合酶，所述t7 rna聚合酶识别质粒上的t7启动子，转录目的基因（goi)翻译成蛋白质，由于，利用t7 rna聚合酶对t7启动子转录具有一个放大的作用，因此，所述质粒在进入肿瘤细胞后可以产生更多量的目标蛋白。
7.第一方面，本技术实施例公开了一种质粒，所述质粒包括：cmv启动子；所述的cmv启动子序列如seq id no：1所示；核糖体结合位点(ires)；所述ires的序列如seq id no：2所示；t7 rna聚合酶基因；所述t7 rna聚合酶基因的序列如seq id no：3所示；t7启动子；所述t7启动子的序列如seq id no：4所示；多聚腺嘌呤核苷酸(pa)序列；所述pa序列为多个腺嘌呤a连在一起组成的rna序列；牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpa)序列；所述bghpa序列如seq id no：5所示；以及目的基因（goi)。
8.进一步地，在构建的质粒中，t7 rna聚合酶基因序列位于真核cmv启动子下游，
bghpa序列位于t7 rna聚合酶基因下游，t7启动子位于bghpa序列下游，ires的序列位于t7启动子下游，目的基因（goi)位于ires下游。
9.进一步地，在构建上述质粒过程中，原核表达的t7启动子来源于t7噬菌体，是一种大肠杆菌表达系统常用的强启动子，它能够对t7 rna聚合酶有特异性反应，被识别后的转录非常活跃；cmv启动子作为增强子/启动子元件，这类元件来源于病毒基因组，cmv启动子是公认的启动真核基因表达最有力量的启动子，在很多真核细胞中都有很强的促进转录的作用，启动效率比较高；ires能够介导不依赖末端的翻译启始过程，ires可在同一个启动子下，表达两个乃至更多基因；因此，通过在目的基因（goi)的上游插入ires序列将能引导t7rnap/启动子转录的mrna在真核细胞中翻译，重组载体中cmv启动子启动t7 rna聚合酶基因转录，翻译产生的t7rna聚合酶，识别质粒上的t7启动子，转录目的基因（goi)翻译成蛋白质。
10.进一步地，牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpa)序列作为转录t7 rna聚合酶基因的终止子序列。
11.第二方面，本技术实施例公开了前述质粒的构建方法，所述方法包括以下步骤：合成目的基因（goi)；构建含有目的基因（goi)的第一重组真核表达质粒；将cmv启动子、核糖体结合位点(ires)、t7 rna聚合酶基因、多聚腺嘌呤核苷酸(pa)序列及牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpa)序列序列重组至第一重组真核表达质粒，获得第二重组真核表达质粒；对所述第二重组真核表达质粒进行筛选，验证，即获得前述质粒。
12.进一步地，合成目的基因（goi)的方法包括化学合成法、pcr扩增法中的至少一种。
13.第三方面，本技术实施例公开了一种前述质粒在肿瘤药物中的应用。
14.第四方面，本技术实施例公开了一种前述质粒在制备mrna药物的应用。
15.第五方面，本技术实施例公开了一种药物，其药物的有效成份包含前述质粒及用于药物组合的辅料。
16.进一步地，所述质粒包含的目的基因（goi)为mgm-csf基因。
17.第六方面，本技术实施例公开了前述质粒在肿瘤细胞的应用。
18.第七方面，本技术实施例公开了前述药物在肿瘤细胞的应用。
19.第八方面，本技术实施例公开了一种重组细胞，所述重组细胞包含前述质粒。
20.第九方面，本技术实施例公开了一种基因工程菌，所述基因工程菌包含第八方面所述重组细胞。
21.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：本技术中涉及一种双启动子质粒、构建方法及其应用，所述质粒包括：真核cmv启动子、核糖体结合位点(ires)、t7 rna聚合酶基因、t7启动子、多聚腺嘌呤核苷酸(pa)序列、牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpa)序列以及目的基因（goi)。所述质粒载体进入肿瘤细胞后，首先由cmv启动子启动t7 rna聚合酶基因转录，翻译产生的t7 rna聚合酶，所述t7 rna聚合酶识别质粒上的t7启动子，转录目的基因（goi)翻译成蛋白质。所述质粒载体通过与目
标基因精确结合，并载入表达系统，获得表达量更高的目标蛋白。
附图说明
22.图1为本技术实施例提供的重组质粒表达结构示意图。
23.图2为本技术实施例提供的小鼠肿瘤体积平均趋势图。
24.图3为本技术实施例提供的小鼠第21天肿瘤平均体积变化图。
25.图4为本技术实施例提供的活体成像观察小鼠荧光信号图。
具体实施方式
26.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
27.在本技术中，术语“基因”指表达特定蛋白质或功能rna分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5
′
非编码区)和之后的调节序列(3
′
非编码区)。“元件”是指(upstream promoter elements)包括通常位于-70bp附近的caat盒和gc盒、以及距转录起始点更远的上游元件。
28.在本技术中，“启动子”指能够控制编码序列或功能rna的表达的dna序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3
′
端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的dna片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。
29.在本技术中，术语“表达”指转录和衍生自基因的编码rna (mrna)或功能rna的稳定积聚，也可指将mrna翻译成多肽或蛋白。
30.在本技术中，术语“信使rna(mrna)”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的rna。
31.在本技术中，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
32.在本技术中，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链dna 分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链dna或rna的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和dna序列与相应的3
′
末端非翻译序列一起引入细胞中。
33.质粒的构建此处目的基因（goi)的合成采用pcr扩增的方法。
34.以mgm-csf为目的基因（goi)为例，本实施例详述重组质粒的构建过程，所述mgm-csf基因的序列如seq id no：6所示。
35.1.设计并合成pcr扩增引物对，所述引物对的核苷酸序列为：p1：如seq id no：7所示；p2：如seq id no：8所示。
36.2.pcr扩增pcr扩增反应体系如表1所示：表1试剂使用量takarataqversion2.025μl模板dna1μlp1（10μm）1μlp2（10μm）1μlddh2o混合液至50μlpcr扩增程序如表2所示：表2步骤温度时间198℃5min298℃10sec355℃30sec472℃35sec 重复步骤2~34个循环 572℃5min3.构建含有mgm-csf目的基因（goi)的第一重组真核表达质粒。
37.分别对pcr扩增产物和原始质粒进行双酶切，电泳检测并回收酶切后的mgm-csf序列和线性化质粒dna。
38.酶切过程中，50μl目的片段酶切体系设计如下：10
×
h buffer ，7μl；酶，各1μl（10u/μl）；pcr扩增产物35μl补足双蒸水至50μl；充分混匀后，37℃酶切（针对pcr扩增产物，酶切4h）。
39.20μl载体酶切体系设计如下：10
×
m buffer ，7μl；酶，各1μl（10u/μl）；质粒（1ug/μl）2μl补足双蒸水至20μl；充分混匀后，37℃酶切（针对pcr扩增产物，酶切4h）。
40.对于所回收的mgm-csf序列和线性化质粒dna，利用t4 dna酶进行连接。
41.连接时，20μl连接体系设计如下：2
×
quick ligation buffer，10μl；
线性质粒dna，200ng；酶切后的mgm-csf序列片段，87.2ng；t4连接酶，1μl（350u/μl）；补足双蒸水至20μl；16℃连接过夜。
42.4.将cmv启动子、核糖体结合位点(ires)、t7 rna聚合酶基因、多聚腺嘌呤核苷酸(pa)序列及牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpa)序列序列重组至第一重组真核表达质粒，获得第二重组真核表达质粒；所获得的第二重组真核表达质粒结构，其表达结构如图1所示。
43.5.转化、筛选。
44.利用氯化钙法制备e.colidh5α感受态细胞，将重组质粒分别转化至e. colidh5α中，涂布在含有100μg/ml氨苄霉素（amp）的lb平板，挑选阳性菌落在含氨苄霉素100μg/ml的lb中培养。筛选出重组质粒体外表达量高且经限制性内切酶鉴别正确的菌种于-70 ℃以下保存，用于扩大培养。
45.重组质粒的应用前述构建质粒包含的目的基因（goi)为mgm-csf基因，其中mgm-csf为表达人巨噬细胞集落刺激因子，刺激树突细胞成熟。
46.本实施例通过前述方法构建目的基因（goi)为mgm-csf基因及绿色荧光蛋白（gfp）基因的重组质粒，其中运载体质粒为pt7ampce，构建的重组质粒分别为pt7ampce mgm-csf、pt7ampce gfp；以小鼠结肠癌模型为实验对象，验证pt7ampce mgm-csf的应用于抗肿瘤的效果。
47.首先，构建ct26结肠癌小鼠模型。
48.在小鼠右侧胁腹皮下注射100 μl含有1
×
10
6 ct26细胞悬液。待荷瘤鼠肿瘤体积达到50~80 mm3时，将所有小鼠随机分为7组。
49.其次，设计重组质粒分组方案，如表3所示。
50.表3is buffer为溶剂对照不含有质粒。
51.所上表所示，pt7ampce gfp组为质粒对照组；is buffer组为非质粒空白对照组。
52.下一步，小鼠体积达到1500mm3后安乐处死小鼠，每周测量小鼠肿瘤体积两次，采用student-t-test统计学分析小鼠体内肿瘤体积结果数据。
53.结果：如图2~3所示，小鼠的肿瘤体积变化对比，经统计学分析表明，pt7ampce mgm-csf质粒组抗肿瘤效果显著优于pt7ampce gfp组。
54.重组质粒在制备mrna药物的应用
本技术实施例中，前述重组质粒可用于制备mrna药物。
55.第一步，通过前述质粒构建方法构建重组质粒；根据要制备的mrna药物的种类，选择不同的目的基因（goi)构建于重组质粒中，如制备一种抗肿瘤细胞的mrna药物，采用一种溶瘤病毒即ii型单纯疱疹病毒（hsv2）的d型囊膜蛋白基因 gd
ed
为目的基因构建重组质粒；第二步，将所述重组质粒进行体外转化（ivt)，将将dna 链转化为 mrna，在这一步中，rna 聚合酶（rna polymerase）会将 dna 转录为 mrna。
56.第三步，递送系统装载。此步是将 mrna 包裹进脂质载体（lnp）中，脂质悬浮于酒精溶液中，与 mrna接触并将其包裹，两种物质通过相反电荷相吸引。
57.第四步，检验灌装，即得到mrna药物。
58.本技术实施例中，用于包封mrna的递送系统采用目前常用或已公开的脂质载体（lnp)，本领域技术人员应用常规技术手段可以得到，这里不做赘述。
59.小鼠肌肉注射质粒观察荧光表达首先，通过前述方法构建目的基因（goi)为萤火虫荧光蛋白（fluc）基因的重组质粒pt7ampce-fluc；其次，选择7周龄的雌性balb/c小鼠为实验小鼠，其中实验组小鼠左右大腿肌肉各注射30μg的pt7ampce-fluc重组质粒，对照组小鼠注射等剂量的is buffer溶剂。48h后小鼠腹腔注射15mg/ml的荧光素底物，小动物活体成像观察小鼠荧光信号。
60.结果：如图4所示：结果表明pt7ampce-fluc重组质粒在肌肉细胞中表达了萤火虫荧光蛋白酶；其中1号小鼠为对照组小鼠，2号小鼠注射了30μg的pt7ampce-fluc重组质粒。
61.综上所述，本技术中涉及一种双启动子质粒、构建方法及其应用，所述质粒包括：真核cmv启动子、核糖体结合位点(ires)、t7 rna聚合酶基因、t7启动子、多聚腺嘌呤核苷酸(pa)序列、牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpa)序列以及目的基因（goi)。所述质粒载体进入肿瘤细胞后，首先由cmv启动子启动t7 rna聚合酶基因转录，翻译产生的t7 rna聚合酶，所述t7 rna聚合酶识别质粒上的t7启动子，转录目的基因（goi)翻译成蛋白质。所述质粒载体通过与目标基因精确结合，并载入表达系统，获得目标免疫蛋白表达量更高。按所述方法，以mgm-csf基因为目的基因（goi)，构建重组质粒，并将该重组质粒用于抗肿瘤治疗，能明显抑制肿瘤细胞的生长速度，治疗效果好。
62.以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。