一种抗猪CD69蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用

一种抗猪cd69蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种抗猪cd69蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途，特别涉及特异性识别和鉴定早期活化的免疫细胞的单克隆抗体、制备方法及其检测应用，属于生物科学和诊断试剂领域。


背景技术：

2.淋巴细胞的早期激活表面标志物cd69(以前也称为ea1、mlr3、aim、leu23或bl-ac/p26)是c型凝集素超家族的ii型膜蛋白(1)。cd69是已知的免疫细胞早期激活分子，可在活化的b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞、单核细胞和粒细胞上表达(2-4)。在实验条件下，佛波酯(pma)体外刺激1小时可诱导t细胞表达cd69，因而检测cd69可很好地指示t细胞的早期激活(2)。通过检测cd69的表达分析免疫细胞的激活状态在人类和小鼠模型上已经广泛开展。但通过检测猪cd69分子的表达来分析猪免疫细胞激活状态的研究几乎还是空白。其关键原因是，缺乏特异性检测猪cd69分子的免疫学工具。
3.猪cd69蛋白序列全长200个氨基酸，含有38个氨基酸的胞内区、26个氨基酸的跨膜区，136个氨基酸的保外区(5)。虽然有日本学者制备了抗猪cd69分子的单抗，但能否用于检测猪感染和免疫条件下免疫细胞的激活尚不明确。目前对于猪淋巴细胞免疫激活的评价可借助间接方法来实现，如ifn-γ酶联免疫斑点法(elispot)、细胞因子胞内染色法等(6,7)。这些方法主要是检测淋巴细胞的晚期激活，而且通常难以区分被激活的细胞类型或者敏感性远不如检测cd69分子的表达。此外，cd69可与鞘氨醇-1-磷酸受体1(s1pr1)结合形成复合物抑制该受体介导的细胞迁移，因而t细胞上调cd69的表达往往代表着t细胞在局部的激活与增殖(8)。而且，cd69的诱导表达也伴随着转录因子ap-1和il-2的表达增加，进而诱导细胞毒性t细胞的产生(9)，最终导致适应性细胞免疫的建立。猪繁殖与呼吸综合征、猪流行性腹泻、猪圆环病毒病等猪病是困扰我国养猪业的顽疾，非洲猪瘟更是给我国养猪业造成了毁灭性的打击。现有的研究更多聚焦于这些病毒诱导的体液免疫反应，通过检测病原特异的抗体滴度来衡量疫苗的保护效果。而对于细胞免疫在其中扮演什么角色目前知之甚少，严重制约了针对这些猪病的疫苗开发和免疫保护机理的研究。本发明通过制备一种特异性识别猪cd69的单克隆抗体，结合不同的猪cd分子标记，通过流式细胞术(fcm)，可以实现直接评估在感染、免疫或体外刺激后不同的猪免疫细胞的活化情况，可用于猪蓝耳病等猪病的疫苗评价、药物筛选以及免疫保护机理解析，是一个非常重要的免疫学工具。


技术实现要素：

4.本发明的目的就是正对上述问题，提供一种抗猪cd69蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种抗猪cd69蛋白单克隆抗体，由保藏编号为cctcc no:c202278的杂交瘤产生。所述杂交瘤的名称(分类命名)为：杂交瘤细胞株5f12；保藏日期为：2022年5月19日；保藏单位全称为：中国典型培养物保藏中心；保藏单
位简称为：cctcc；保藏编号为：cctcc no:c202278；保藏地址为：中国武汉武汉大学。
6.所述单克隆抗体能够特异性结合猪免疫细胞早期激活标志cd69膜蛋白。
7.一种单克隆抗体所识别的抗原表位位于猪cd69蛋白氨基酸序列的140-162位，其氨基酸序列为：
8.140-aehwiglknedgqtwkwsngkef-162。
9.单克隆抗体能够特异性识别经抗原刺激或佛波酯和离子霉素刺激后活化的猪淋巴细胞以及能够特异性识别真核转染表达的猪cd69抗原。
10.经纯化、标记不同的荧光素后可用于流式细胞术和间接免疫荧光试验检测猪感染或疫苗免疫后b细胞、γδt细胞、cd8 t、cd4、cd4+cd8+t淋巴细胞、nk细胞cd69的表达变化。
11.将任何含有氨基酸序列140-aehwiglknedgqtwkwsngkef-162的多肽与载体蛋白偶联或融合表达，免疫小鼠或兔，通过杂交瘤技术筛选得到的单克隆抗体。
12.本发明方法先进科学，本发明所要解决的技术问题是研制出能够在流式细胞术染色中特异性识别表达cd69分子的活化的猪淋巴细胞的单克隆抗体。还要解决的技术问题是提供抗猪cd69的单克隆抗体的科学完善的制备方法。同时要解决的技术问题是提供内容所述的抗猪cd69的单克隆抗体在猪cd69鉴定的其它相关试验技术方面的应用性。还要解决的技术问题是提供了该单克隆抗体的抗体类型和亚型类别。
13.通过本发明，明确抗原表位，所述单克隆抗体针对的抗原表位位于猪cd69蛋白的第140～162位氨基酸。合成抗原多肽表位，并免疫小鼠。对免疫阳性小鼠进行细胞融合并筛选出阳性单克隆杂交瘤细胞。对阳性杂交瘤细胞株分泌的抗体进行识别活性鉴定、效价鉴定和流式细胞术分析鉴定。
14.本发明通过制备一种特异性识别猪cd69的单克隆抗体，结合不同的猪cd分子标记，通过流式细胞术，可以实现直接评估在感染、免疫或体外刺激后不同的猪免疫细胞的活化情况，可用于猪蓝耳病等猪病的疫苗评价、药物筛选以及免疫保护机理解析，是一个非常重要的免疫学工具。
15.本发明有益效果为：
16.本发明解决了免疫学研究中长期存在的无法通过流式细胞术直接评价猪免疫细胞在猪感染或疫苗免疫后的早期激活的问题。本发明中的抗猪淋巴细胞早期活化抗原cd69的单克隆抗体能够高效特异性识别受到感染或体外刺激后发生活化的免疫细胞，有效弥补了兽医免疫学领域直接快速评价猪免疫细胞早期活化的空白，从而极大方便了今后猪抗感染免疫应答等相关领域的研究。且此单克隆抗体便于生产，易于在今后流式细胞术、免疫印迹等技术领域的普及和应用。
附图说明
17.图1为western blot鉴定5f12识别猪cd69活性及应用性鉴定；图中，m，蛋白标准参照；1，猪cd69蛋白,2，增强型绿色荧光蛋白做阴性对照；3，未转染细胞做阴性对照。
18.图2为ifa鉴定5f12识别天然构象猪cd69的活性及应用性鉴定；图中，1,5f12单抗杂交瘤培养上清；2,抗猪cd69阳性多抗血清检测真核表达的cd69作为阳性对照；3，阴性杂交瘤培养上清检测cd69做阴性对照。
19.图3为fcm检测猪cd69在猪外周血淋巴细胞的表达及fcm应用性分析；图中，1，阴性
杂交瘤培养上清做阴性对照；2,5f12杂交瘤培养上清；3，抗猪cd69阳性多抗血清染cd69做阳性对照；*，差异显著，p《0.05。
20.图4为fcm鉴定猪cd69在猪外周血不同免疫细胞亚群的表达情况；无刺激,不刺激组；pma/iono刺激，佛波酯/离子霉素刺激组。
21.图5为prrsv感染后t细胞的激活；未感染，无任何病原体感染的阴性对照组；prrsv感染，蓝耳病毒感染的猪pbmc；cd3+t，cd3阳性t淋巴细胞；cd69+cd4+t，感染后活化的cd4淋巴细胞；cd69+cd8+t，感染后活化的cd8淋巴细胞(细胞毒性淋巴细胞)；*，差异显著，p《0.05。
22.保藏信息
23.所述杂交瘤的名称(分类命名)为：杂交瘤细胞株5f12；保藏日期为：2022年5月19日；保藏单位全称为：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称为：cctcc；保藏编号为：cctcc no:c202278；保藏地址为：中国武汉武汉大学。
具体实施方式
24.为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由所附的权利要求具体限定。
25.实施例1cd69抗原多肽的合成。
26.设计了一种23个氨基酸的定制多肽，由猪cd69的23个氨基酸残基(140～162)组成，并与钥孔血蓝蛋白(klh)共价结合。猪cd69蛋白的第140～162位氨基酸为其抗原表位，氨基酸序列如下：140-aehwiglknedgqtwkwsngkef-162。
27.实施例2阳性杂交瘤细胞构建。
28.1.免疫小鼠与细胞融合；
29.取6-8周龄balb/c小鼠，按每只小鼠取20μg多肽抗原与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化完全。对小鼠进行腹腔注射，并于初免2周后，进行二次免疫及三次免疫，对免疫效果较好的进行加强免疫，三天后进行骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合。在融合前一天取腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞。将sp2/0细胞与无菌获取的免疫脾细胞混匀，离心去上清后用融合剂50％(w/v)peg-1500诱导细胞融合，用dmem不完全培养基重悬细胞，再次离心完全弃去上清，以终止细胞融合。融合后的细胞用hat培养基培养于37℃,5％co2细胞培养箱。
30.2.杂交瘤细胞的选择性筛选及克隆化培养；
31.细胞培养至第8-10天后改用ht培养基。取细胞培养上清进行抗体检测。对第一次检测呈阳性反应的杂交瘤细胞孔三天后再次进行抗体检测，选取有强阳性反应的细胞进行扩大培养，并通过有限稀释法进行亚克隆，挑选出强阳性反应的单克隆孔进行保存，以建立能够稳定传代并持续高效分泌特异性抗体的单克隆细胞株：杂交瘤细胞株5f12。
32.实施例3抗体活性及效价的鉴定；
33.1.pcdna3.1-猪cd69真核表达质粒的构建；
34.参照ncbi上公布的猪cd69基因编码区碱基序列，分别设计上下游引物，引物序列如表1，引物由擎科生物科技公司合成。
35.表1猪cd69上下游引物序列
[0036][0037][0038]
利用rt-pcr扩增了猪cd69基因的cdna，并定向克隆到真核表达载体pcdna3.1，对单克隆质粒进行测序，将测序正确的质粒保存并命名为pcdna3.1-猪cd69。
[0039]
2.western blot试验鉴定单抗对猪cd69线性表位的识别活性；
[0040]
将真核质粒pcdna3.1-猪cd69、pcdna3.1-egfp分别转染hke-293t细胞，并设置一个转染空质粒的阴性对照。培养后收获细胞样品进行western blot鉴定，以5f12杂交瘤培养上清作为一抗进行检测，二抗使用1:5000稀释的hrp-羊抗小鼠。结果如图1所示，只有在转染并表达猪cd69蛋白抗原的1号涌道出现大小不同的两条特异性条带，由于猪cd69在真核内表达后会经过两种不同的糖基化修饰因而形成大小不同两条链，该结果符合客观事实，证明5f12单抗可以用于猪cd69的常规western blot检测鉴定。
[0041]
3.间接免疫荧光试验(ifa)鉴定单抗识别活性；
[0042]
分别将pcdna3.1-猪cd69和pcdna3.1空载体转染hek-293t细胞，培养后收获细胞，使用甲醇丙酮将细胞固定，经脱脂乳封闭，分别使用阳性杂交瘤培养基上清作为一抗、羊抗鼠-af488荧光二抗进行孵育。充分浸洗后用荧光显微镜观察细胞染色情况。结果如图2所示，阴性对照无绿色荧光，而试验组由于转染并表达了猪cd69蛋白并被猪cd69单克隆抗体所识别，因此细胞呈现明亮的绿色荧光。结果表明所获得的猪cd69单克隆抗体具有识别真核表达的猪cd69蛋白的活性，可以用于后续fcm鉴定及相关领域的鉴定。
[0043]
4.elisa鉴定抗体效价；
[0044]
将猪cd69多肽抗原包被于96孔酶标版并经过脱脂乳封闭，将猪cd69单克隆抗体细胞培养上清按照倍比稀释至1:25600，并依次铺于该酶标版，酶标板经过室温孵育和浸洗，并用二抗hrp-羊抗小鼠进行二次孵育。将酶标板充分浸洗后加入elisa底物反应液并用浓硫酸终止反应。随后用酶标仪测定450nm波长吸收峰值。结果表明本试验获取的猪cd69单抗在25600倍的高稀释度下仍然能够特异性识别猪cd69抗原多肽，即抗体效价高达1：25600。
[0045]
实施例4抗体类型及亚型的鉴定；
[0046]
利用双夹心elisa方法对所获单抗5f12进行抗体类型和亚型的鉴定。结果表明，5f12单克隆抗体属于igg1类，k链亚型。
[0047]
实施例5单克隆抗体在fcm中的应用；
[0048]
1.取无特定病原体的两月龄仔猪外周血，使用猪单个核细胞分离试剂盒对外周血进行分离，获得猪外周血单个核细胞,计数后取适量细胞铺于96孔u型细胞培养板，使用含有pma/ionomycin的培养基刺激培养6小时使细胞活化，并设置无pma/ionomycin刺激的阴性对照。
[0049]
2.收获刺激后的pbmc，低速离心弃上清，以5f12培养基上清重悬细胞并进行室温孵育；并分别使用未免疫小鼠阴性血清和免疫小鼠阳性血清稀释液孵育细胞作为阴性和阳性对照。弃掉一抗上清，使用羊抗鼠-af488荧光二抗稀释液重悬细胞，继续室温孵育30分钟。低速离心弃掉上清后以0.5％多聚甲醛重悬细胞，对细胞进行固定。细胞样品用于fcm分析，结果如图3所示。结果表明，大部分淋巴细胞经过刺激培养后发生活化，且被5f12单克隆
抗体高效特异性识别。
[0050]
实施例6猪cd69在外周血不同免疫细胞群的表达情况分析鉴定；
[0051]
试验采取与实施例5中所述的试验方式，对cd69和其它免疫细胞亚群膜表面标志cd3(cd3+t细胞)/cd4(cd4+cd3+t细胞)/cd8(cd8+cd3+t细胞)/cd21(b细胞)/γδtcr(γδt细胞)进行共染色，利用fcm分析cd69在猪外周血不同免疫细胞亚群的表达情况。结果如图4所示。经过pma/iono活化后，部分b细胞表达cd69，γδt细胞低表达cd69，cd4+、cd8+及cd4+cd8+双阳性t细胞和nk细胞可以表达cd69，从而建立了利用此cd69单抗分析猪不同淋巴细胞亚群活化情况的方法。
[0052]
实施例7prrsv感染后t细胞的激活；
[0053]
为了评估猪淋巴细胞在猪体感染prrsv这种猪重大病原体后的早期活化情况，分别设置不感染病毒组(3头猪)，prrsv感染组(3头猪)，于感染后第5天取猪外周血单个核细胞(pbmc)直接进行cd69的fcm分析鉴定，试验操作方法同实施例6，结果如图5所示。在prrsv感染下，猪体内cd4和cd8淋巴细胞发生活化，表明cd69单抗5f12可以用于猪感染相应病原体后的免疫细胞的活化研究。