一株花脸香蘑、其非糖类提取物的制备及其应用

1.本发明涉及药用真菌提取物领域，尤其涉及一株花脸香蘑、其非糖类提取物的制备及其应用。


背景技术：

2.花脸香蘑(lepista sordida)属于口蘑科、香蘑属真菌。其菌盖幼时半球形，后平展，湿润时半透明或水浸状；边缘内卷，具不明显的条纹，常呈波状或瓣状；菌肉呈淡紫罗兰色，较薄，菌褶直生，有时稍弯生；菌柄紫罗兰色，实心，基部多弯曲；担孢子宽椭圆形至卵圆形，粗糙至具麻点，无色。该菌分布广泛，夏秋季多在山坡草地、草原、菜园、堆肥等处群生或近丛生，常形成草原蘑菇圈。
3.花脸香磨不仅具有较高的营养价值，还有很高的药用价值。罗心毅等测定了人工代料栽培的花脸香蘑子实体中18种元素：指出花脸香磨子实体中含有丰富的人体抗氧化、增强免疫、抗衰老的se、zn、ge、fe等必需微量元素。而且花脸香磨子实体中含对人体有害金属cd、hg、pb的含量低于欧洲白林地蘑菇(agarcussilvoid)、紫丁香蘑(lepistaudua)、网纹马勃(lycoperdonperlatum)等25种野生蘑菇约20～100倍。通过研究比较，花脸香蘑子实体中含se量是中国黑龙江省木兰县新民公社克山病区稻米中se含量的40倍，是水果，蔬菜，大米，玉米，猪肉，牛肉，蛋，牛奶等的几倍甚至几十倍。花脸香蘑具有富集硒、锗等抗癌抗衰老等多种微量元素，有害重金属元素达到fda(美国)食品及药物管理局标准。作为一种珍稀食用菌，花脸香蘑具有重要的药用，食用开发应用价值。
4.但是，目前花脸香磨的药用价值的研究主要集中于粗蛋白和粗多糖等大分子物质成分的研究，所以目前研究该菌的抗肿瘤和护肝等作用也往往归因于菌丝中的多糖成分；然而，本领域现有的研究并未开发花脸香蘑的小分子非糖类活性成分的价值，也缺少相应的非糖类活性成分的提取制备和鉴定的方法。
5.而甘氨胆酸是一种新发现的肝细胞癌患者的生物标志物，被发现存在于动物胆汁中，能够诱导大鼠肝癌细胞凋亡(黄文方等，2000)，提高肿瘤细胞对化疗的耐药性(yl.lo，2018)，还具有保护视网膜色素上皮细胞免受氧化损伤的功效(2021)，能显著降低炎症大鼠血清中一氧化氮的含量，对急慢性炎症均有显著的抑制作用(李慧峰，2006)。甘氨胆酸还能提高小鼠肝、脑组织中mda和sod活性，对机体有一定的抗氧化作用(乌云夫，2013)。
6.目前，少量现有技术公开了通过化学合成甘氨胆酸的方法，如公开号为cn101817860b、in6800delnp2011a的专利，但是其活性以及应用安全性等方面不如天然甘氨胆酸；而目前天然甘氨胆酸主要提取自牛羊鹅等动物的胆汁，不仅来源有限，且提取工艺复杂，成本较高。而目前尚未发现从易于繁殖的细菌或真菌中提取甘氨胆酸的任何研究和报道。
7.因此，现有技术有待进一步改进。


技术实现要素：

8.针对上述问题，本技术首次发现一株能够以生物合成途径产生甘氨胆酸的真菌-花脸香蘑(蒙花l1)，并提供了一种利用该真菌制备含有甘氨胆酸的非糖类提取物的制备方法，该方法操作简单，成本低于现有技术，制备获得的小分子非糖类提取物具有很好的抗肿瘤和护肝作用，具有很好的应用前景。
9.本技术的技术方案具体如下：
10.第一方面，本发明提供一株花脸香蘑(lepista sordida)，其被命名为蒙花l1，保藏时间为2022年4月28日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学)，保藏号为cctcc m 2022511。
11.经过大量实验证明，从花脸香蘑蒙花l1中提取的非糖类提取物，含有甘氨胆酸，具有抑制肿瘤的作用。
12.第二方面，本技术还提供上述花脸香蘑在制备抗肿瘤和护肝药物中的应用。由于花脸香蘑蒙花l1中提取的非糖类提取物具有抑制肿瘤的作用，富含甘氨胆酸这种活性成分，因此，花脸香蘑蒙花l1可用于制备抗肿瘤和护肝药物。
13.第三方面，本发明提供上述花脸香蘑在制备甘氨胆酸类提取物中的应用。本发明的内容说明上述花脸香蘑中富含甘氨胆酸，通过分离和纯化的方法可提取其中的甘氨胆酸类物质，基于方法的不同得到的甘氨胆酸类物质的纯度和杂质不同。例如采用下述的制备方法分离纯化最终得到的小分子非糖类提取物为甘氨胆酸类物质。
14.第四方面，本发明提供一种花脸香蘑的非糖类提取物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
15.s1、将上述花脸香蘑菌体接种于液体培养基中，于20-22℃条件下培养得到种子液，将种子液接种于液体培养基中，震荡培养2～4d。优选地，培养时间为72h。
16.s2、接着进行降温处理：将培养温度降为5～15℃震荡培养24～72h；再进行复温处理：将培养温度回复到20-22℃继续培养60-80h，摇床转速为150rpm/min，得到初步发酵液。
17.经过实验证明，不经过变温处理，经过该方法制备得到的精提物中未发现甘氨胆酸类活性成分。因此，该步骤是关键步骤，此步骤的作用在于：减少花脸香蘑菌体的产生数量和速度，为次级代谢产物-甘氨胆酸类的产生提供物质基础和时间。
18.优选地，上述步骤s2中，降温处理的条件为：10℃培养48h。实验证明，该实验条件下，甘氨胆酸的产量最高，为最优反应条件。
19.s3、低温冷藏处理：将上一步得到的初步发酵液存放于1-6℃环境下低温静置12～96h。
20.研发过程中偶然发现，经过冷藏处理后，发酵液中的甘氨胆酸的产量显著提升，其产量增加10-20％左右。并且，实验结果显示，在一定时间范围内，发酵液中的甘氨胆酸的产量随着冷藏时间的延长而逐渐增加，但是冷藏60h与冷藏96h的效果差异不明显。
21.因此，优选地，上述步骤s3中，低温冷藏处理的条件为：4℃环境下低温处理60h。
22.s4、将经低温冷藏处理后的发酵液过滤中的菌丝球进行去除，保留上清液。实验证明，甘氨胆酸类活性成分主要分布在发酵液上清中。
23.s5、对上述上清液初步纯化处理，得到粗提物；再对粗提物溶液进行制备hplc纯化，分离得到精提物，即小分子非糖类提取物。
24.经质谱检测发现，该小分子非糖类提取物的主要成分为甘氨胆酸，这是首次在花脸香蘑中提取发现胆酸类化合物，且实验发现该类提取物具有良好的抗肿瘤和护肝的效果，具有广阔的应用前景。
25.优选地，上述步骤s5中，初步纯化处理方法为：对上清液进行醇沉，去沉淀后保留得到的上清液；透析并留取200-500da的上清液，通过旋转蒸发去除乙醇和水分后得到粗提物，再用乙醇萃取该粗提物。
26.优选地，hplc纯化采用甲醇-水洗脱体系，水和甲醇的体积比为：1：(4-10)，提取液的流速为0.2ml/min。可选地，采用的色谱柱为柱hypersil c18，柱温为30℃。
27.优选地，上述液体培养基包括以下质量百分数的各组分：0.1～0.2％的黄腐酸、10％～20％的麦草汁、1～5％的葡萄糖、0.1-0.5％酵母粉、0.1～0.2％的kh2po4、0.05～0.1％的mgso4和0.01～0.05％的维生素b1，溶剂为水。
28.所述黄腐酸(简称fa)是腐殖酸中分子量最小的，易溶于水，ph值约5左右。实验证明，添加黄腐酸有助于甘氨胆酸类成分的合成，有助于提高甘氨胆酸的产量，以满足提取的要求。实现发现：黄腐酸的分子量小，活性基团含量高，通过抑制或激活酶，而作用于花脸香蘑的新陈代谢，对其次级代谢产物
‑‑
甘氨胆酸的合成起到的重要作用。
29.进一步优选地，上述液体培养基包括以下质量百分数的各组分：葡萄糖3％，酵母粉0.3％，黄腐酸0.1％，麦草汁15％，mgso
4 0.05％，kh2po4，0.1％，维生素b1，0.01％，溶剂为水。
30.第五方面，本技术还提供一种花脸香蘑的非糖类提取物，其采用上述方法制备得到。
31.本发明具有以下有益效果：
32.1、本发明首次发现一株能够以生物合成途径产生甘氨胆酸的真菌-花脸香蘑(蒙花l1)，具有很高的食用、药用和农业应用价值。首先，花脸香蘑蒙花l1是中国内蒙古呼伦贝尔草原的野生菌经驯化选育后实现大量栽培出菇的菌株，其栽培成本低且产量高，其可高效利用废弃草料、农作物秸秆和动物畜禽粪等实现大规模人工栽培，表现为爆发性出菇，出菇后的菌渣可用于培肥地力，具有生态意义。其次，花脸香蘑蒙花l1在食品加工、药品加工或保健品加工中具有潜在的应用前景，可用于制备甘氨胆酸类小分子非糖类提取物，其可广泛应用于制备抗肿瘤、护肝、抗氧化等药物，具有广泛的应用前景。
33.2、本发明提供一种花脸香蘑中的小分子非糖类提取物的制备方法，该方法是针对小分子非糖类提取物的性质所设计；不同于现有的花脸香蘑提取物的制备方法的繁琐步骤，该方法的操作简单易行，采用的萃取溶剂类型少，萃取步骤耗时短，提取效果好。
34.通过该方法获得的非糖类提取物的主要成分是甘氨胆酸，这是首次在花脸香蘑中提取发现胆酸类化合物，并发现该类提取物具有良好的抗肿瘤和护肝的效果；此前甘氨胆酸化合物主要采用化学合成方式获取，这是首次从真菌中提取到甘氨胆酸类物质，其不仅具有更好的应用前景，并且充分开发了花脸香蘑的应用价值，提高了这种药用真菌的利用率。
附图说明
35.图1为蒙花l1子实体孢子印及担孢子电镜形态；
36.图2为菌株蒙花l1菌丝生长状态及驯化栽培子实体形态；
37.图3为菌株蒙花l1实验室小试与大棚中试出菇实验；
38.图4为花脸香蘑精提物液质联用-阴离子的高效液相色谱图谱；
39.图5为花脸香蘑精提物的阴离子质谱图谱；
40.图6为花脸香蘑精提物液质联用-阳离子的高效液相色谱图谱；
41.图7为花脸香蘑精提物的阳离子质谱图谱；
42.图8为实施例4的色谱峰面积积分比的结果。
具体实施方式
43.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
44.实施例1花脸香蘑(lepistasordida)菌株蒙花l1的驯化和鉴定
45.1、蒙花l1菌株分离与驯化栽培
46.(1)实验方法：本发明人从内蒙草原上采集的野生菌子实体，在无菌环境下进行组织分离和纯化，优化培养条件，并栽培出菇。然后筛选出菇后的子实体重新进行组织分离和纯化，制作菌种并栽培出菇，先后经过实验室小试和大棚中试后，筛选出适合大面积推广的栽培菌株，定名为蒙花l1。
47.(2)实验结果及分析：蒙花l1菌落边缘整齐，菌丝呈发散状生长，致密粗壮，生长后期呈现淡紫色，以匍匐菌丝为主，有少量气生菌丝(见图2)。
48.2、鉴定
49.(1)实验方法：采用形态学鉴定结合分子鉴定的方法
50.(2)实验结果及分析：
51.a、形态学鉴定：
52.该菌子实体中等大，菌盖扁半球形至平展，有时中部稍下凹，盖薄，湿润时水浸状，污白至淡紫色，老后边缘常呈波状或瓣状。菌肉带淡紫色，菌褶淡紫色，稍稀，直生，有时稍延生，不等长。菌柄同菌盖色，靠近基部常弯曲，内实。孢子印为淡土黄色，电镜下孢子呈椭圆形，长约4.5～5um，宽约2.6～3um，表面不平整。对照卯晓岚(2009)《中国蕈菌》等关于花脸香蘑的记载，鉴定为花脸香蘑。
53.b、菌种分子鉴定：
54.采用ezna fungal dna kit试剂盒提取蒙花l1的菌丝dna，对样品rdna的its区的pcr扩增采用t5 direct pcr kit(plant)试剂盒，将扩增产物送至上海生工生物公司测序。测序得到的序列见序列表的seq id no:1，通过ncbi在线blast，将该基因序列与genbank中已被测序成功的序列进行同源性比对，结果表明，该真菌的its序列与花脸香蘑(lepistasordida)的同源性最高，达到99％。
55.因此，结合上述形态学鉴定和分子鉴定，将该真菌鉴定为一株新的花脸香蘑(lepistasordida)。随后，将该花脸香蘑(lepistasordida)菌株蒙花l1进行保藏，保藏时间
为2022年4月28日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc m 2022511。
56.实施例2花脸香蘑
‑‑
蒙花l1的非糖类提取物的制备
57.1、实验方法：
58.(1)花脸香蘑的培养和发酵
59.液体培养基的配方为：葡萄糖3％，酵母粉0.3％，黄腐酸0.1％，麦草汁15％，mgso
4 0.05％，kh2po4，0.1％，维生素b1，0.01％，其余为水。将配置的液体培养基进行高压灭菌处理。
60.将花脸香蘑的菌丝体接种于100ml液体培养基中，将花脸香蘑菌体接种于液体培养基中，于20-22℃震荡培养60h后，得到种子液，将种子液按照10％的接种量接种于200ml的液体培养基中，震荡培养72h后培养温度降为10℃震荡培养48h，然后培养温度回复20℃继续培养72h，摇床转速为150rpm/min，得到发酵液。
61.(2)花脸香蘑的变温培养和低温处理。
62.培养72h后培养温度降为10℃震荡培养48h，然后培养温度回复20℃继续培养72h，培养液存放于4℃环境下低温处理60h，此步骤有助于花脸香蘑在逆境下诱导表达目标产物。
63.(3)粗提物的制备
64.将经过低温处理后的发酵液过滤，将菌丝球除去，只留发酵液液体部分(即前述的上清液)。接着对液体部分进行醇沉，去沉淀留上清液。
65.对上清液进行透析，留取200-500da的上清液，旋转蒸发去除乙醇和水分，得到粗提物。
66.(4)活性成分的提取
67.以乙醇作为溶剂萃取粗提物体，浸泡12h，使用滤纸进行过滤，去除杂质得到初级提取液.
68.(5)对初级提取液的透析处理
69.取2段透析袋，截留分子量为200-500da的初级提取液，并进行封口，使透析袋悬于盛有蒸馏水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌促进溶液交换，直至透析平衡为止。经过上述透析处理后，将初级提取液中的大分子物质分子去除，得到次级提取液。
70.(6)纯化处理
71.对次级提取液进行高效液相色谱纯化处理，使用的是hypersil c18柱(规格为2.1
×
100mm,5μm；thermo fisher scientific,waltham,usa)，柱温为30℃，次级提取液以0.2ml/min的流速在两维的纳米液相系统进行。
72.洗脱过程中，洗脱剂a采用水，洗脱剂b为甲醇洗脱体系，在两种洗脱剂的体积比为：1:(4-10)的洗脱条件下，色谱保留时间15-16min，收集纯化产物，即花脸香蘑乙醇精提物。采用液质联用对纯化得到的小分子非糖类提取物的结构进行鉴定。
73.(7)质谱分析
74.对乙醇精提物进行质谱分析，电喷雾质谱分析在50-1500m/z的核质比范围内进行正离子和负离子全扫描，氮气作为雾化气体，流速为6l/min；温度为180℃；压力为1.0bar，数据采集和处理使用随仪器提供的lc/ms数据分析软件(版本4.1)。对应于特定的元素组成
的核质比数据使用随仪器提供的公式预测软件来计算。要求测量出的核质比与物质的标准核质比之间的误差不超过5ppm。
75.2、实验结果及分析
76.(1)鉴定纯化处理后的小分子非糖类提取物，其阴离子色谱图见图4，阳离子色谱图见图6。
77.(2)阴离子质谱结果见图5，通过对质谱图谱的分析，得知最大峰为分子离子峰，其阴离子质谱的m/z值为464.3052，阴离子质谱测定主要活性成分的分子式为c
27h39
n5o2(阴离子c
27h38
n5o2加h)；因为该化合物有氨基，所以阳离子质谱也同时测定出该物质的阳离子的m/z值为466.3188(见图7)，阳离子离子质谱显示其的分子式为c
27h39
n5o2(阴离子c
27h40
n5o2减h)，结合分析阴离子和阳离子质谱的数据，最终确定：该化合物为甘氨胆酸类物质。
78.(3)对照组中，不进行添加0.1％黄腐酸和变温处理步骤后，对该对照组提取的花脸香蘑的精提物进行检测，发现：对照组的精提物中未发现上述甘氨胆酸类化合物，这说明：不经变温处理和添加0.1％黄腐酸处理的花脸香蘑
‑‑
蒙花l1无法表达足量的可提取到的甘氨胆酸类物质。
79.实施例3花脸香蘑小分子非糖类提取物的体外抑制肿瘤实验
80.1、肿瘤细胞的培养：
81.人肝癌细胞株smmc(购自潍坊医学院)，用含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的rpmi1640培养液在37℃、5％co2的条件的培养箱中进行培养，待细胞呈对数期生长后得到人肝肿瘤细胞。
82.2、样品组的设置：
83.按照以下方法分别设置实验组和对照组，每组设置至少3个重复：
84.①
实验组1：按照上述完整实验步骤制备出花脸香蘑乙醇精提物，将其作为样品；
②
实验组2：与实验组1方法基本相同，仅省去变温处理和添加0.1％腐殖酸处理步骤，收集提取物作为样品；
③
阳性对照组：以化学合成的甘氨胆酸作为样品。
85.将各实验组的样品分别加入无菌蒸馏水溶解，配置成的溶液备用。
86.3、抑制肿瘤的活性测定
87.(1)细胞凋亡的检测：实验组1和实验组2以及阳性对照组，用350μmol/l的剂量的样品作用于肝癌smmc细胞72h后，染色后用流式细胞仪检测。
88.(2)抑制肿瘤的计算方法：用spss软件进行分析行t检验分析，p《0.05具有统计学意义。
89.(3)用annexin v-fitc指标检测细胞凋亡。
90.4、实验结果及分析
91.(1)如表1的结果可知，实验组1和阳性对照组的细胞凋亡率相当，实验组1的细胞凋亡率高于阳性对照组；上述结果说明，本发明的方法制备的非糖类提取物的主要成分是生物合成的甘氨胆酸，其比化学合成的甘氨胆酸具有更高的抑制肿瘤的活性，原因在于生物合成的甘氨胆酸分子结构比化学合成的生物活性高，因此花脸香蘑变温发酵生产甘胺胆酸具有很好的应用前景，为肝癌的防治带来新的思路。
92.(2)与实验组2相比，实验组1的细胞凋亡率明显升高，结果有显著差异，这说明：本技术制备的抑制肿瘤活性成分的精提物是在变温培养以及添加腐殖酸的条件下存在的，因
此，变温培养和添加腐殖酸是重要的实验步骤。
93.表1肝癌smmc细胞72h细胞凋亡率
[0094][0095]
注：n＝3,与对照组比p《0.05
[0096]
实施例4制备方法的变温处理条件的优化实验
[0097]
1、实验方法：
[0098]
(1)设置12个实验组，分别置于5℃、10℃、15℃条件下进行24h，48h，72h，96h变温处理，其他步骤与实施例2的其他步骤的操作相同。用色谱峰面积积分比法来表示甘氨胆酸的产量高低。
[0099]
2、实验结果及分析
[0100]
从图8的实验结果显示，以10℃培养48h的变温处理的条件最佳，这种条件下制备的提取物中甘氨胆酸的产量最高，因此将实施例2的变温处理的条件选定为10℃，处理48h。
[0101]
实施例5培养基的优化
[0102]
1、实验设置：
[0103]
按照表2的设置对筛选的培养基的碳源、氮源、黄腐酸和mg
2+
进行正交试验。设9个处理，每个处理5个重复。所用水为添加15％麦草汁的蒸馏水，另外添加0.1％kh2po4，0.01％维生素b1。
[0104]
表2花脸香蘑液体发酵正交因素水平表l9(34)
[0105][0106]
2、实验结果及分析
[0107]
从表3的结果可知，根据极差分析得出的液体培养基的最优配方为a3b3c1d3，因此菌丝发酵的适宜配方为：葡萄糖3％，酵母粉0.3％，黄腐酸0.1％，麦草汁15％，mgso
4 0.05％，kh2po4，0.1％，维生素b1，0.01％。
[0108]
表3培养基成分对蒙花l1液体发酵的影响
[0109][0110][0111]
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。