抗敌菌灵单克隆抗体、单克隆细胞株及应用

1.本发明属于食品安全免疫检测领域，具体涉及抗敌菌灵单克隆抗体、单克隆细胞株及应用。


背景技术：

2.敌菌灵是一种杀菌剂，适用于防治蔬菜的霜霉病，灰霉病，褐斑病等，广泛应用于粮食蔬菜等农作物。然而，研究发现，长期食用含有过量敌菌灵的食品会引起慢性中毒，与皮肤接触也会引起刺激作用，严重影响人类的健康，因而有些国家对食品中敌菌灵的含量有严格的限制，如：gb2763-2005的限量要求为原粮≦0.2mg/kg，cac的限量要求为大麦≤0.2mg/kg。
3.相关技术中，敌菌灵含量分析方法有气质联用(gc-ms)、高效液相色谱法 (hplc)、液质联用(lc-ms)等仪器方法，这些方法在不同程度上存在一些缺陷：耗时，步骤繁琐，无法进行现场快速检测，昂贵的仪器和大量的样品预处理程序等。因此，这些方法不适合现场进行高通量检测分析敌菌灵含量。因此，迫切需要设计一种准确度高、可操作性强的检测分析食品中敌菌灵含量的方法。


技术实现要素：

4.为解决相关技术中存在的问题，本发明提供一种分泌抗敌菌灵单克隆抗体的单克隆细胞株、单克隆抗体及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对敌菌灵具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立敌菌灵酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法，为间接竞争elisa试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。
5.本发明是通过以下具体技术方案来实现的：
6.一株分泌抗敌菌灵单克隆抗体的单克隆细胞株，已于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株 pt0，保藏编号cgmcc no.45106，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
7.一种用于制备上述单克隆细胞株的敌菌灵半抗原，其分子式如下式(1)或(2)所示：
[0008][0009]
一种抗敌菌灵单克隆抗体，其是由上述保藏编号为cgmcc no.45106的单克隆细胞株分泌产生。
[0010]
一种抗敌菌灵单克隆抗体的制备方法，包括：取balb/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为cgmcc no.45106的单克隆细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的敌菌灵单克隆抗体低温保存。
[0011]
所述单克隆细胞株pt0在敌菌灵检测中的应用、在制备敌菌灵免疫检测试剂盒中的应用或在制备敌菌灵检测胶体金试纸条中的应用。
[0012]
所述抗敌菌灵单克隆抗体在敌菌灵检测中的应用、在制备敌菌灵免疫检测试剂盒中的应用或在制备敌菌灵检测胶体金试纸条中的应用。
[0013]
一种试剂盒，包括所述的单克隆细胞株pt0或所述的抗敌菌灵单克隆抗体。
[0014]
可选地，所述试剂盒，还包括酶标板、敌菌灵包被抗原、敌菌灵标准液、酶标记二抗和底物反应液。
[0015]
所述的试剂盒在敌菌灵分析检测中的应用。
[0016]
一种胶体金试纸条，包含所述的单克隆细胞株pt0或所述的抗敌菌灵单克隆抗体。
[0017]
所述的胶体金试纸条在敌菌灵分析检测中的应用。
[0018]
本发明提供的细胞株pt0的制备基本步骤为：
[0019]
(1)敌菌灵半抗原1的制备：将敌菌灵(化合物1)溶解于丙酮中，再将6
‑ꢀ
溴已酸乙酯(化合物2)加入至该溶液中，并水浴搅拌，离心，取上清，然后将丙酮吹干，得到化合物3，再加入无水乙醇和naoh溶液，并水浴下搅拌。再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯提取液，最后将乙酸乙酯吹干得到化合物4，即敌菌灵半抗原1；
[0020]
(2)免疫原敌菌灵-bsa的制备：敌菌灵半抗原1，1-乙基碳二亚胺盐酸盐，和n-羟基琥珀酰亚胺，用无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，得到a1液，室温搅拌反应6h。取牛血清蛋白bsa(敌菌灵半抗原与bsa摩尔比为60:1)，用硼酸盐缓冲溶液溶解，得到b1液，在室温条件，逐滴
将a1液加入到b1液中，室温反应8h，即得偶联物敌菌灵-bsa的混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物敌菌灵-bsa，即敌菌灵免疫原；
[0021]
(3)小鼠的免疫：将敌菌灵免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21 天，最后一次用敌菌灵-bsa完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)检测血清效价和抑制；
[0022]
(4)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(peg 4000)法，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法 (ic-elisa)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得分泌抗敌菌灵单克隆抗体的单克隆细胞株pt0；
[0023]
(5)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度和特异性。
[0024]
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0025]
1、本发明提供的单克隆细胞株pt0分泌的抗敌菌灵单克隆抗体，对敌菌灵具有较好的特异性和检测灵敏度(ic50值为0.19ng/ml)，为检测粮食、蔬菜和其他含有敌菌灵的食品中敌菌灵的含量提供了免疫学检测方法。
[0026]
2、本发明提供的单克隆细胞株pt0及其分泌的抗敌菌灵单克隆抗体可制成用于检测敌菌灵的试剂盒、胶体金试纸条等，具有实际应用价值。
[0027]
3、本发明提供的合成敌菌灵半抗原、免疫原的方法，合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。
[0028]
生物材料保藏
[0029]
一株分泌抗敌菌灵单克隆抗体的单克隆细胞株，分类命名为：单克隆细胞株 pt0，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.45106，保藏日期为：2022年03月03日。
附图说明
[0030]
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0031]
图1是本发明的一个示例性实施例中敌菌灵半抗原1的合成路线；
[0032]
图2是本发明的一个示例性实施例中敌菌灵半抗原2的合成路线；
[0033]
图3是敌菌灵单克隆抗体的标准抑制曲线。
具体实施方式
[0034]
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0035]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0036]
rpmi-1640培养基(mg/l)：l-精氨酸290、l-门冬酰胺50、l-门冬氨酸20、 l-胱氨酸二盐酸盐65.15、l-谷氨酸20、甘氨酸10、l-组氨酸15、l-羟脯氨酸 20、l-异亮氨酸50、l-亮氨酸50、l-赖氨酸盐酸盐40、l-甲硫氨酸15、l-苯丙氨酸15、l-脯氨酸20、l-丝氨酸30、l-苏
氨酸20、l-色氨酸5、l-酪氨酸23.19、 l-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、 l-谷氨酰胺300、生物素0.2、d-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素b12 0.005、碳酸氢钠2000。
[0037]
下述实施例中涉及的试剂如下：
[0038]
碳酸盐缓冲液(cbs)：称取na2co3 1.59g，nahco3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至 1000ml，4℃贮存备用。
[0039]
磷酸盐缓冲液(pbs)：8.0g nacl，0.2g kcl，0.2g kh2po4，2.9g na2hpo4
·
12 h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
[0040]
洗涤液(pbst)：1000ml的0.01mol/lph7.4的pbs溶液中加入0.5ml 的tween
–
20；
[0041]
pbst：含0.05％tween
–
20的pbs；
[0042]
抗体稀释液：将明胶(0.50g)煮沸化开，加入50ml抗稀浓缩液(10
×
)，超纯水定容至500ml，4℃保存备用；
[0043]
tmb显色液：a液：na2hpo4.12h2o 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至 1000ml；b液：60mg tmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1:5混合即为tmb显色液，现用现混。
[0044]
下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0045]
敌菌灵的抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-elisa中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(cbs)将抗原稀释至0.01μg/ml，0.03μg/ml，0.1 和0.3μg/ml，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.01,0.03,0.1和0.3μg/ml。选择最佳工作点后，将敌菌灵标准品稀释为7个浓度(0，0.01852ng/ml，0.05556ng/ml， 0.16667ng/ml，0.5ng/ml，1.5ng/ml，4.5ng/ml，13.5ng/ml)，按照ic-elisa 操作步骤，最后用originpro 8.5做图(结果如图3所示)，获得敌菌灵的标准抑制曲线，计算ic
50
。
[0046]
实施例1敌菌灵人工抗原的制备：
[0047]
1.1敌菌灵半抗原1合成路线，参见图1：
[0048]
称取敌菌灵(化合物1)275.00mg(1mmol),将其溶解于20ml丙酮溶液中，再将6-溴已酸乙酯(化合物2)112mg(0.5mmol)加入至该溶液中，并于56℃水浴下搅拌48h。离心，取上清，然后将丙酮吹干，得到化合物3，再加入14ml无水乙醇和6ml 1mol/ml naoh,并于75℃水浴下搅拌8h；用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯提取液，最后将乙酸乙酯吹干得到化合物4(240mg)，即敌菌灵半抗原1。
[0049]
1.2敌菌灵半抗原2合成路线，参见图2：
[0050]
称取敌菌灵(化合物1)275.00mg(1mmol),将其溶解于20ml dnso溶液中，然后加入112.00mg(2mmol)氢氧化钾和巯基丙酸(化合物5)106.00mg(1 mmol)于该溶液中，并于100℃油浴下搅拌2h。待产物冷却至室温后，加入20ml 超纯水，以5mol/ml hcl调节ph为3，用20ml二氯甲烷萃取，收集下层溶液。用3ml nahco3水溶液萃取，收集上层；用少量乙醚洗涤水相，弃去乙醚层；用5mol/ml hcl溶液调节水相ph为3，然后用5ml乙酸乙酯分3次萃取，合并乙酸乙酯提取液。用蒸馏水洗涤乙酸乙酯，弃水层。提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。加入少量丙酮溶液溶解，静置过夜，有晶体析出，即为敌菌灵半抗原2。
[0051]
1.3敌菌灵免疫原，即偶联物敌菌灵半抗原1-bsa的制备：
[0052]
称取3.52mg敌菌灵半抗原1，1-乙基碳二亚胺盐酸盐5.06mg，n-羟基琥珀酰亚胺
3.04mg，用800μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，得到a1液，室温搅拌反应6h。取牛血清蛋白bsa 10mg(敌菌灵半抗原与bsa摩尔比为60:1)，用3 ml 0.1m硼酸盐缓冲溶液溶解，得到b1液，在室温条件，逐滴将a1液加入到 b1液中，室温反应8h，即得偶联物敌菌灵半抗原1-bsa的混合液，再通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物敌菌灵半抗原1-bsa，即敌菌灵免疫原。
[0053]
1.4敌菌灵包被原，即偶联物敌菌灵半抗原2-ova的制备：
[0054]
称取5.08mg敌菌灵半抗原2，1-乙基碳二亚胺盐酸盐7.64mg，n-羟基琥珀酰亚胺4.61mg，用800μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，得到a2液，室温搅拌反应6h。称取10mg鸡卵清白蛋白ova(敌菌灵半抗原与ova摩尔比为60:1)，溶解于3ml 0.1m硼酸盐缓冲溶液中，得到b2溶液，在室温条件下，逐滴将 a2液加入到b2液中，室温反应8h，即得偶联物敌菌灵半抗原2-ova混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物敌菌灵半抗原 2-ova，即敌菌灵包被原。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于小鼠，是制备单抗必需的。
[0055]
实施例2：分泌抗敌菌灵单克隆抗体单克隆细胞株的制备
[0056]
2.1动物免疫的获得：
[0057]
选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的敌菌灵免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5ul+995ul抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-elisa测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。通过间接竞争酶联免疫法(ic-elisa) 观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
[0058]
2.2细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为4000) 方法进行细胞融合，具体步骤如下：
[0059]
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
[0060]
b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10％fbs(胎牛血清)rpmi-1640培养基在5％co2培养箱中。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1～4
×
107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
[0061]
c、融合过程7min。第1min，将1ml peg 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1ml rpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2ml rpmi-1640培养基；第7min，每10 s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50
×
hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
[0062]
2.3细胞筛选与细胞株建立
[0063]
在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5 天进行用
含20％胎牛血清，1％的100
×
ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用敌菌灵为标准品，用ic-elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对敌菌灵标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得分泌抗敌菌灵单克隆抗体细胞株pt0。
[0064]
实施例3：敌菌灵单克隆抗体的制备
[0065]
取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸
‑ꢀ
硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01m pbs溶液(ph 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
[0066]
实施例4：敌菌灵单克隆抗体的应用
[0067]
(1)将碳酸盐缓冲液(cbs)稀释好的0.1μg/ml的敌菌灵包被原包被加入 96孔酶标板，每孔100μl，37℃包被2h后，用pbst洗液洗板三次，每次每孔 200μl，每次3min，拍干；
[0068]
(2)用含0.2％明胶的cbs进行封闭，每孔加入200μl，37℃封闭2h，用 pbst洗液洗板三次，每次每孔加入200μl洗液，洗涤三次，拍干；
[0069]
(3)用磷酸盐缓冲液(pbs)分别配置0.01852ng/ml，0.05556ng/ml，0.16667 ng/ml，0.5ng/ml，1.5ng/ml，4.5ng/ml，13.5ng/ml的敌菌灵标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μl，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μl1：16000稀释的敌菌灵单克隆抗体，37℃反应半小时后，洗板拍干；
[0070]
(4)将hrp标记的羊抗鼠igg二抗用抗体稀释液稀释3000倍，然后将其按照每孔100μl加入96孔酶标板中，37℃反应半小时后，洗板拍干；
[0071]
(5)每孔加入100μl tmb显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μl 2m h2so4终止液，450nm测吸光值；
[0072]
用ic-elisa测定单克隆抗体敌菌灵的ic50为0.19ng/ml，并验证了其对地克珠利等的ic
50
及交叉反应率，具体如表1所示。说明对敌菌灵有很好的灵敏度和特异性，可用于敌菌灵免疫分析检测。
[0073]
表1抗敌菌灵单克隆抗体对药物的ic
50
及交叉反应率
[0074][0075]
实施例5：敌菌灵免疫检测试剂盒
[0076]
本实施例提供一种敌菌灵免疫检测试剂盒，其包含实施例3制备的敌菌灵单克隆抗体、酶标板、敌菌灵包被抗原、敌菌灵标准液、hrp标记的羊抗鼠igg 二抗和tmb显色液。
[0077]
敌菌灵免疫检测试剂盒检测敌菌灵的原理为：采用间接竞争elisa法检测待测样本中敌菌灵的含量。酶标板微孔内预先包被敌菌灵包被抗原，加入敌菌灵标准液或待测样品、敌菌灵单克隆抗体、hrp标记的羊抗鼠igg二抗和tmb显色液，制作敌菌灵标准抑制曲线，根据敌菌灵标准抑制曲线和待检测样品的吸光度值，确定待检测样品中的敌菌灵含量。采用本领域常用方法进行操作即可实现敌菌灵的检测。
[0078]
实施例6：敌菌灵检测胶体金试纸条
[0079]
本实施例提供一种胶体金试纸条，其包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，所述胶体金结合垫上包被实施例3制备的敌菌灵单克隆抗体。所述检测线由敌菌灵包被抗原印制得到。所述质控线由羊抗鼠igg二抗印制得到。胶体金试纸条的组装方式采用本领域常用方式即可。
[0080]
敌菌灵检测胶体金试纸条检测敌菌灵的原理为：利用间接竞争elisa法原理检测待测样品中是否含有敌菌灵。如果待测样品中含有敌菌灵，则检测线不显色，质控线显色。如果待测样品中不含有敌菌灵，则检测线和质控线均显色。采用本领域常用方法进行操作即可实现敌菌灵的检测。
[0081]
通过以上实施例可以看出，本发明关于敌菌灵的人工抗原的合成步骤简洁，有效，可有效用于免疫分析中，为后续的的研究分析提供了方便的途径，提供的细胞株pt0分泌的单克隆抗体，对具敌菌灵有较好的特异性和检测灵敏度(ic
50
为0.19ng/ml)，可实现对粮食、
蔬菜等食品中敌菌灵残留量的检测，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的敌菌灵检测方法提供了新手段。
[0082]
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。