靶向HER2，PD-L1和VEGF的三特异性抗体的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向her2，pd-l1和vegf的三特异性抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、面对涉及多种信号通路的复杂疾病，针对单一靶点的单克隆抗体治疗方法通常疗效有限。因此，开发能够同时结合多个不同靶点的多特异性抗体成为抗体药物发展的新趋势。这些多特异性抗体提供了新的治疗策略，例如在免疫疗法背景下的多种细胞受体的协同靶向，因而提供了更好的治疗控制的希望。例如，美国公开号2006/0193852描述了一种抗cd3×cd19双特异性抗体，其通过t细胞标志物和肿瘤细胞标志物的双特异性结合来靶向并杀死特异性肿瘤细胞群体。

2、her2(也称为neu、erbb-2、cd340或p185)属于人表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族成员，自身无胞外配体，可通过自身二聚化或与其他人表皮生长因子受体家族成员发生异源二聚化而激活胞内信号途径，促进细胞的增殖(wang,z.(2017)，“erbb receptors andcancer”，methods mol biol 1652:3-35)。在包括乳腺癌和胃癌在内的多种实体肿瘤中，her2存在基因扩增、蛋白质表达水平升高等情况，导致肿瘤细胞恶性程度增加。因此，her2已成为her2+实体瘤治疗的重要靶点，多款靶向her2的单抗药物已获批上市，包括罗氏制药和基因泰克联合开发的曲妥珠单抗(trastuzumab)、基因泰克开发的帕妥珠单抗(pertuzumab)以及靶向her2的adc药物t-dm1和ds-8201(oh,d.y.和y.j.bang(2020)，“her2-targeted therapies-a role beyond breast cancer”，nat rev clin oncol 17(1):33-48)。此外，国内外多款靶向her2的生物类似药也已获批上市。但是靶向her2的单克隆抗体往往反应率低且容易产生耐药性，例如90％的患者会在1年内对曲妥珠单抗产生耐药性。

3、血管内皮生长因子(vegf)为血管生成的关键调控因子，能够促进血管出芽及新生血管形成。vegf的表达受缺氧及炎症等多种因子控制，当vegf表达上调时，血管出现异常增生。vegf是存在病理性血管生成相关疾病的重要药物靶点，如实体肿瘤和眼病(包括糖尿病眼病、年龄相关黄斑变性等)(apte,r.s.等人(2019)，“vegf in signaling and disease:beyond discovery and development”，cell 176(6):1248-1264)。

4、程序细胞死亡1配体1蛋白(pd-l1)是重要的免疫检查点pd-1的配体，pd-1/pd-l1的结合能够促进t细胞的凋亡，同时抑制t细胞发挥抗肿瘤活性，多种肿瘤细胞通过表达pd-l1来逃避免疫系统的监视(jiang,y.等人(2020)，“progress and challenges in precisetreatment of tumors with pd-1/pd-l1blockade”，front immunol 11:339)。因此，阻断pd-l1与pd-1相互作用的抗体可激活适应性免疫系统来对抗肿瘤，在肿瘤治疗中具有非常广泛的适应性。

5、目前，国内外已有多款针对her2、pd-l1和vegf的单克隆抗体药物获批上市。然而，由于肿瘤的异质性，这些药物在临床治疗中存在应答率偏低，治疗耐受和易复发等现象。多特异性抗体可以同时靶向多个抗原，在提高抗肿瘤药物安全性和解决现有单克隆抗体药物应答不足及耐药方面具有非常大的潜力(zhang,j.等人(2020)，“development ofbispecific antibodies in china:overview and prospects”，antib ther 3(2):126-145)。因此，开发新的具有多重抗肿瘤活性的双特异性抗体或多特异性抗体以提高治疗应答率或克服治疗耐受在肿瘤的临床治疗中具有重要的意义。

6、尽管多特异性抗体具有前景，但它们的生产和使用受到许多实际因素的限制。例如目前制备多特异性抗体的平台/方法常面临相关联重链和轻链对之间的高保真配对难题、组装的抗体稳定性较差、抗体链的表达和折叠不良、亲和力降低、产生免疫原性肽、脱靶效应和/或复杂的体外组装反应或纯化方法等问题。这些问题限制了多特异性抗体的开发和应用。此外，不同抗体组件的组合和排布方式对于抗体平台的可生产性具有影响，并且与简单分子不同，这种影响常常难于进行理论预测。不仅如此，超出两链的抗体分子的制备也常常会对表达系统和下游工艺提出额外的要求。

7、目前制备的多特异性抗体，由于其抗原结合位点较少，往往影响该抗体与抗原的结合能力。例如，赛诺菲(sanofi)公司最近开发了针对her2/cd3/cd28的三特异性抗体，发现该三特异性抗体会通过cd4免疫细胞抑制乳腺癌细胞的生长。但是，该三特异性抗体对每个靶点只有一个结合位点，而经典抗体对每个靶点有两个结合位点，因此，该三特异性的总结合强度或亲和力比典型抗体药物低数千倍，这影响了该三特异性抗体效用的发挥。

8、来自重链抗体的vhh结构域，由于具有小尺寸(15kd)、易于操作和良好稳定性等多种独特优势，已经被提出用作多特异性抗体构件。但由于vhh与常规抗体可变区在结构上的差异，在基于vhh的抗体平台设计中，常常会遇到不同于常规可变区为构件时的影响因素。例如，lukas pekar等人提出，可以以vhh替换常规igg抗体的可变结构域vh和vl，来产生多特异性抗体分子(lukas pekar等人(2020)，biophysical and biochemicalcharacterization of a vhh-based igg-like bi-and trispecific antibodyplatform,mabs 12(1),1812210)。然而，在研究中，lukas等人发现，尽管该平台样式在应用于形成单价双/三特异性抗体时总体的生产性能较好，但随着抗原结合位点和/或特异性的增加，该平台抗体的生产性能受到不同程度的影响，尤其是基于该平台的多价三特异性抗体，在许多情况下，表现出了显著下降的可生产性质，在表达和蛋白a纯化后一半以上测试抗体的sec纯度甚至低于65％，这就为后期的抗体下游生产工艺带来困难。

9、截止目前，依然鲜有报道同时靶向her2、pd-l1和vegf的多特异性抗体。因此，迫切存在同时靶向her2、pd-l1和vegf，通过多重机制发挥协同抗肿瘤功能的三特异性抗体的需求。

10、本技术解决了上述问题。本技术构建了同时靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其利用肿瘤的微环境递送精准的免疫调节信号组合，从而有效地提高了治疗应答率并克服现有治疗面临的治疗耐受难题，比由三种单特异性抗体构成的组合疗法更为安全和有效。

技术实现思路

1、本发明提供了一种新型的同时靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，所述抗体的每个特异性结合抗原的臂(简称抗原臂)与同源的单抗抗原臂具有相似的亲和力，表明构建的三特异性抗体各个臂之间干扰很小，由此该三特异性抗体同时保留了各抗原结合位点的良好的抗原结合特异性、选择性以及良好的生物活性。相比单一疗法和联合用药，靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体具有多重优势：一方面，三特异性抗体可以协同发挥adcc、肿瘤细胞增殖抑制、pd-1/pd-l1阻断以及vegf中和等多重抗肿瘤活性，提高对her2阳性肿瘤的治疗效果；另一方面，有望解决单药或联合用药治疗中的治疗耐受难题。

2、本发明提供的三特异性抗体分子是包含6个抗原结合位点的对称分子。其对称结构使得该抗体的组装可以采用类似于天然igg分子的方式，避免了多特异性抗体生产中常见的链错配现象，从而提高了组装效率和产率，因而简化了抗体生产和纯化的操作，提高了效率，降低了费用。本发明提供的三特异性抗体具有良好的溶解度、纯度和热稳定性，这些都是进一步下游开发的关键特征。此外，本发明抗体分子针对每个靶点具有两个相同的抗原结合位点，因此基本上保留了相应天然2价抗体对靶点的结合能力，从而避免了现有技术公开的三特异性抗体低亲和力的问题。

3、在第一方面，本发明提供了同时靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，所述抗体包含两条相同的第一多肽和两条相同的第二多肽，其中所述三特异性抗体包含以下结构：

4、1)第一多肽从n端到c端包含：vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc-(y)m-vhh2；

5、第二多肽从n端到c端包含：vl-cl；

6、或

7、2)第一多肽从n端到c端包含：vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc；

8、第二多肽从n端到c端包含：vhh2-(y)m-vl-cl；

9、其中，vhh1表示结合第一靶点的第一vhh结构域、vhh2表示结合第二靶点的第二vhh结构域、vh和vl组合结合第三靶点；

10、其中，x和y表示连接子，且n＝0或1，m＝0或1；

11、其中，fc表示免疫球蛋白重链fc结构域，ch1表示免疫球蛋白重链ch1结构域，cl表示免疫球蛋白轻链cl结构域，

12、其中，两条第一多肽的fc结构域相互配对同二聚化，vh-ch1和vl-cl相互配对形成fab，由此形成类似天然igg免疫球蛋白的4聚体结构；

13、其中，vhh1和vhh2结合互不相同的靶点。

14、在一个实施方案中，ch1与vh来源于相同类型的免疫球蛋白分子。在另一个实施方案中，ch1、hinge和fc来源于相同类型的免疫球蛋白分子。在一个优选的实施方案中，包含ch1结构域和fc结构域的重链恒定区结构域来源于igg型免疫球蛋白，尤其来源于人igg免疫球蛋白，例如igg1、igg2、igg3或igg4免疫球蛋白。在一个更优选的实施方案中，包含ch1结构域和fc结构域的重链恒定区结构域来源于igg1型免疫球蛋白，尤其来源于人igg1。

15、在一个实施方案中，包含ch1结构域和fc结构域的igg1重链恒定区结构域包含seqid no:26的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。

16、在一个实施方案中，vl和cl来源于相同类型的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，cl是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。

17、在一些实施方案中，n＝1，m＝1。在一些实施方案中，x与y可以相同或不同。在一个实施方案中，x和y分别独立地为长度8-30个氨基酸的连接子。在一个优选实施方案中，x和y包含如seq id no:5所示的氨基酸序列或由其组成。

18、在一个实施方案中，vh和vl来源于靶向her2的单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，vh和vl来源于曲妥珠单抗。在进一步优选的实施方案中，vh包含如seq id no:2所示的序列或由其组成、vl包含如seq id no:3所示的序列或由其组成。

19、在一个实施方案中，vhh1和vhh2分别结合pd-l1或vegf。

20、在一个实施方案中，在具有vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc-(y)m-vhh2结构的第一多肽和具有vl-cl结构的第二多肽的三特异性抗体中，所述vhh1和vhh2分别结合pd-l1或vegf。在一个优选的实施方案中，所述vhh1来源于靶向pd-l1的抗体，所述vhh2来源于靶向vegf的抗体。在进一步优选的实施方案中，所述vhh1来源于靶向pd-l1的d21-4抗体，所述vhh2来源于靶向vegf的p30-10-26抗体。在一个优选的实施方案中，所述vhh1包含如seq idno:1所示的序列或由其组成，所述vhh2包含如seq id no:4所示的序列或由其组成。

21、在一个实施方案中，在具有vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc-(y)m-vhh2结构的第一多肽和具有vl-cl结构的第二多肽的三特异性抗体中，所述vhh1和vhh2分别结合pd-l1或vegf。在一个优选的实施方案中，所述vhh1来源于靶向vegf的抗体，所述vhh2来源于靶向pd-l1的抗体。在进一步优选的实施方案中，所述vhh1来源于靶向vegf的p30-10-26抗体，所述vhh2来源于靶向pd-l1的d21-4抗体。在一个优选的实施方案中，所述vhh1包含如seq idno:4所示的序列或由其组成，所述vhh2包含如seq id no:1所示的序列或由其组成。

22、在一个实施方案中，在具有vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc结构的第一多肽和具有vhh2-(y)m-vl-cl结构的第二多肽的三特异性抗体中，所述vhh1和vhh2分别结合pd-l1或vegf。在一个优选的实施方案中，所述vhh1来源于靶向pd-l1的抗体，所述vhh2来源于靶向vegf的抗体。在进一步优选的实施方案中，所述vhh1来源于靶向pd-l1的d21-4抗体，所述vhh2来源于靶向vegf的p30-10-26抗体。在一个优选的实施方案中，所述vhh1包含如seq idno:1所示的序列或由其组成，所述vhh2包含如seq id no:4所示的序列或由其组成。

23、在一个实施方案中，在具有vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc结构的第一多肽和具有vhh2-(y)m-vl-cl结构的第二多肽的三特异性抗体中，所述vhh1和vhh2分别结合pd-l1或vegf。在一个优选的实施方案中，所述vhh1来源于靶向vegf的抗体，所述vhh2来源于靶向pd-l1的抗体。在进一步优选的实施方案中，所述vhh1来源于靶向vegf的p30-10-26抗体，所述vhh2来源于靶向pd-l1的d21-4抗体。在一个优选的实施方案中，所述vhh1包含如seq idno:4所示的序列或由其组成，所述vhh2包含如seq id no:1所示的序列或由其组成。

24、在一个实施方案中，本发明提供了靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其具有结构为vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc-(y)m-vhh2的2条第一多肽和结构为vl-cl的2条第二多肽，其中vhh1结合pd-l1，包含如seq id no:12-14所示的3个cdr，vhh2结合vegf，包含如seq id no:15-17所示的3个cdr，vh结合her2序列，包含如seq id no:18-20所示的3个重链cdr，vl结合her2，包含如seq id no:21-23所示的3个轻链cdr。

25、在一个实施方案中，本发明提供了靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其具有结构为vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc-(y)m-vhh2的2条第一多肽和结构为vl-cl的2条第二多肽，其中第一多肽中的vhh1包含如seq id no:1所示的序列或由其组成，vh包含如seqid no:2所示的序列或由其组成，vhh2包含如seq id no:4所示的序列或由其组成，第二多肽中的vl包含如seq id no:3所示的序列或由其组成。

26、在一个实施方案中，本发明提供了靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其具有结构为vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc的2条第一多肽和结构为vhh2-(y)m-vl-cl的2条第二多肽，其中vhh1结合pd-l1，包含如seq id no:12-14所示的3个cdr，vh结合her2，包含如seq id no:18-20所示的3个重链cdr，第二多肽中的vhh2结合vegf，包含如seq id no:15-17所示的3个cdr，vl结合her2，包含如seq id no:21-23所示的3个轻链cdr。

27、在一个实施方案中，本发明提供了靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其具有结构为vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc的2条第一多肽和结构为vhh2-(y)m-vl-cl的2条第二多肽，其中vhh1结合vegf，包含如seq id no:15-17所示的3个cdr，vh结合her2，包含如seq id no:18-20所示的3个重链cdr，第二多肽中的vhh2结合pd-l1，包含如seq id no:12-14所示的3个cdr，vl结合her2，包含如seq id no:21-23所示的3个轻链cdr。

28、在一个实施方案中，本发明提供了靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其具有结构为vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc的2条第一多肽和结构为vhh2-(y)m-vl-cl的2条第二多肽，其中第一多肽中的vhh1包含如seq id no:1或4所示的序列或由其组成，vh包含如seq id no:2所示的序列或由其组成，第二多肽中的vhh2包含如seq id no:4或1所示的序列或由其组成，vl包含如seq id no:3所示的序列或由其组成。

29、在一个实施方案中，本发明提供了靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其具有结构为vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc-(y)m-vhh2的2条第一多肽和结构为vl-cl的2条第二多肽，其中第一多肽包含如seq id no:6所示的序列或由其组成或包含与seq id no:6具有至少90％同一性且包含相同cdr的序列，第二多肽包含如seq id no:7所示的序列或由其组成或包含与seq id no:7具有至少90％同一性且包含相同cdr的序列。

30、在一个实施方案中，本发明提供了靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其具有结构为vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc的2条第一多肽和结构为vhh2-(y)m-vl-cl的2条第二多肽，其中第一多肽包含如seq id no:8所示的序列或由其组成或包含与seq id no:8具有至少90％同一性且包含相同cdr的序列，第二多肽包含如seq id no:9所示的序列或由其组成或包含与seq id no:9具有至少90％同一性且包含相同cdr的序列。

31、在一个实施方案中，本发明提供了靶向her2、pd-l1和vegf的三特异性抗体，其具有结构为vhh1-(x)n-vh-ch1-hinge-fc的2条第一多肽和结构为vhh2-(y)m-vl-cl的2条第二多肽，其中第一多肽包含如seq id no:10所示的序列或由其组成或包含与seq id no:10具有至少90％同一性且包含相同cdr的序列，第二多肽包含如seq id no:11所示的序列或由其组成或包含与seq id no:11具有至少90％同一性且包含相同cdr的序列。

32、第二个方面，本发明提供了编码本发明抗体分子的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体，优选地表达载体。

33、第三个方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是本领域通用的原核细胞和真核细胞。

34、第四个方面，本发明提供了一种用于产生本发明三双特异性抗体的方法，包括步骤(i)在适于表达本发明第一方面的三特异性抗体的条件下培养本发明第三方面的宿主细胞，任选地，(ii)回收本发明的三特异性抗体。

35、第五个方面，本发明提供了一种包含本发明三特异性抗体的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供的药物组合物还包含其它治疗剂，以及任选的药用辅料；优选地，所述其它治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂。

36、第六个方面，本发明提供了本发明三特异性抗体、药物组合物的用途，用于治疗、预防和/或诊断癌症。

37、在一个实施方案中，本发明提供了第一方面所述的抗体、第二方面所述的多核苷酸和载体、第三方面所述的宿主细胞、第五方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防和/或诊断癌症。

38、第七个方面，本发明提供了治疗、预防和/或诊断癌症的方法，包括将有效量的本发明的三特异性抗体，或本发明的药物组合物施用给有需要的患者。在一个实施方案中，所述癌症例如是乳腺癌，胃癌，卵巢癌，胃食管交界处癌，膀胱癌，小肠癌和壶腹癌，食道癌、肺癌和宫颈癌。