用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及应用于恒温扩增体系下冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、近几年来，随着生物技术的飞速发展，核酸检测在临床诊断和动物疾病诊断等方面得到了广泛应用，恒温扩增技术也在此背景下出现。恒温扩增技术是指一种在恒温条件下即可实现快速、高效地获取大量核酸的方法。恒温扩增技术包括滚环核酸扩增(rollingcircle amolification，rca)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，lamp)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification，rpa)、链替代扩增(strand displacement amplification，sda)、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence based amplification，nasba)和解链酶扩增(helixdependent amplification，had)等等【yan l,zhou j,zheng y,et al.isothermalamplified detection of dna and rna[j]molecμlar biosystems,2014,10(5):970-1003.】。该技术与传统的pcr相比有着高效、快速且不用专用设备等优点，已经运用到多个领域，特别是应用于微生物病原菌检测，例如非洲猪瘟病毒、2019-ncov检测等领域【cord cuphoff,hans g drexler.,detection of mycoplasma contamination in cell cultures[j]current protocols in molecμlar biology,2014,28.4.1-28.4.14】。当前。

2、恒温扩增技术用到的试剂包括各种酶、缓冲液、盐离子、寡核苷酸等成分，为保护这些成分的活性及效果，需要在低温条件下储存、运输，成本较高，且需反复冻融降低了生物活性。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法。

2、传统的核酸检测试剂，如pcr检测试剂，也存在低温运输及反复冻融问题。因此，市面上存在冻干检测试剂盒，该试剂盒中包含冻干的酶以及液体形式的其余组分。然而，恒温扩增技术用到的是多种衡量成分的混合体系，只将其中的一种或一部分组分进行冻干处理，剩余部分不进行冻干处理，或者将多种组分分开进行冻干处理，其产生的误差会影响后续的实验，使实验的重复性无法得到保障，其未冻干的液体部分仍需要考虑低温储存、运输问题。

3、一方面，本发明提供了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂。

4、该冻干辅助试剂由包含缓冲液或保护成分、核酸扩增原料、激活盐、冻干赋形剂或冻干保护剂的混合溶液冻干而成。

5、在一些方式中，所述冻干赋形剂或冻干保护剂包括以下一种或多种：

6、(1)糖醇类：海藻糖、棉籽糖、葡聚糖、糊精、聚乙二醇、甘露醇、甘油；

7、(2)氨基酸或蛋白质类：丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、牛血清蛋白、酪蛋白；

8、(3)表面活性剂：曲拉通x-100、吐温-80、乙基苯基聚乙二醇-40；

9、(4)无水溶剂：二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。

10、优选地，所述冻干赋形剂或冻干保护剂由海藻糖、棉籽糖和甘露醇组成。

11、优选地，混合溶液中海藻糖、棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为5.0％～10.0％、1.0％～6.0％和1.0％～10.0％。

12、优选地，混合溶液中海藻糖、棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为6.0％～7.0％、1.5％～3.0％和1.0％～3.0％。

13、优选地，海藻糖、棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为6.5％、2.0％和2.0％。

14、进一步地，发明人对具体的冻干条件进行了优化，发现将所述辅助试剂的混合溶液以液滴的形式滴入液氮，可快速凝固成固体小球，再于冻干机中冻干，可进一步减小冻干损失。此外，恒温扩增反应体系的总体积微小，一滴混合溶液正好为一份恒温扩增反应辅助试剂的量。

15、具体地，所述混合溶液的冻干包括以下步骤：

16、s1将所述混合溶液滴入液氮中，液滴在液氮中迅速凝固成小球；

17、s2将步骤s1的小球置于冻干机中冻干。

18、在一些方式中，所述液滴的体积在200μl及以下，优选10～100μl。

19、与将混合溶液直接放入冻干机冻干相比，将固体小球于冻干机中冻干，活性损失率极大降低。

20、进一步，冻干机的冻干程序为：-45℃，0帕，1小时；-40℃，1帕，6小时；-30℃，1帕，20分钟；-20℃，1帕，20分钟；-10℃，1帕，20分钟；0℃，1帕，90分钟；10℃，1帕，30分钟；20℃，1帕，30分钟；25℃，1帕，1小时。在该条件下，即可是固体小球完全干燥，又能有效降低所述辅助试剂的质量和活性损失。

21、在一些方式中，所述混合溶液还包括以下的一种或多种物质：二硫苏糖醇、磷酸肌酸、咪唑、腺嘌呤核苷三磷酸(atp)。

22、在一些方式中，所述激活盐包括以下一种或多种盐离子：镁离子、镍离子、锰离子。

23、在一些方式中，所述核酸扩增原料包括上游引物、下游引物、内引物、外引物、探针、脱氧核糖核苷酸(dntp)、核糖核苷酸中(ntp)的一种或多种。

24、在一些方式中，所述缓冲液或保护成分包含以下一种或多种：三羟甲基氨基甲烷、钠离子、钾离子、氯离子、醋酸根离子、硫酸根离子。

25、在一些方式中，所述核酸恒温扩增反应为酶促重组扩增反应，所述混合溶液包括如下组分：

26、 名称 浓度 三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液ph8.0 50-100mm 乙酸钾 50-100mm 乙酸镁 5-20mm 聚乙二醇(分子量20000) 2.5-10％ atp 1-10mm 磷酸肌酸 10-50mm 咪唑 20mm dntp(25mm each) 0.45mm 海藻糖 6.0％～7.0％ 棉籽糖 1.5％～3.0％ 甘油 1.0％～3.0％

27、优选地，所述混合溶液中各组分的浓度如下：

28、

29、

30、所述酶促重组扩增反应用于检测草鱼呼肠孤病毒gcrv vp7时，所述混合溶液还包括：

31、上游引物gcrv-i-f：5’-cccacgccaacgtcaagaccattcaagactcc-3’；

32、下游引物gcrv-i-r：5’-tccaattcgtgatagtctacagtacggctacc-3’；

33、荧光探针gcrv-i-pb：5’-caaatgaagccattcgctcattagtcgaag(fam-dt)g(thf)g(bhq1-dt)gacaaagcgcagacc(c3-spacer)-3’。

34、优选地，上游引物gcrv-i-f和下游引物gcrv-i-r的浓度为0.42mm、荧光探针gcrv-i-pb的浓度为0.12mm。

35、所述酶促重组扩增反应用于检测sars cov 2假病毒时，所述混合溶液还包括：

36、上游引物covs-f：5’-tgccaataggtattaacatcactaggttt-3’；

37、下游引物covs-r：5’-tctgagagagggtcaagtgcacagtctac-3’；

38、荧光探针covs-pb：5’-cttgctttacatagaagttatttgactcc(fam-dt)(thf)g(bhq1-dt)gattcttcttcagg-3’(c3-spacer)。

39、优选地，上游引物covs-f和下游引物covs-r的浓度为0.42mm，荧光探针covs-pb的浓度为0.12mm。

40、所述酶促重组扩增反应用于检测嗜水气单胞菌时，所述混合溶液还包括：

41、上游引物ah-f：5’-cggttatgatgtcaccctacgttacgatac-3’；

42、下游引物ah-r：5’-cacggattgcgacagggaggtggtggtaga-3’；

43、荧光探针ah-pb：5’-tcaccctacgttacgatactgccaccaac(fam-dt)g(thf)(bhq1-dt)ccaagaccaataccta-3’(c3-spacer)。

44、优选地，上游引物ah-f和下游引物ah-r的浓度为0.42mm，荧光探针ah-pb为0.12mm。

45、在一些方式中，所述核酸恒温扩增反应为环介导等温扩增反应，所述混合溶液包括如下组分：

46、

47、

48、所述环介导等温扩增反应用于检测虾白斑综合症病毒时，所述混合溶液还包括：

49、内引物wssv-fip：cgcatatttccctctatcgctattattttttagcacagattttttgat；

50、内引物wssv-bip：ggtctgaaatatacatgggtgcctttttgaaaatggggtttacgacaa；

51、外引物wssv-f3：ggtaaaggaacgttttgttg；

52、外引物wssv-b3：gcaatgggaatgataactctt。

53、优选地，内引物的浓度均为0.8μm，外引物的浓度均为0.1μm。

54、本发明的另一方面，提供了用所述冻干辅助试剂进行恒温扩增反应的方法和试剂盒。

55、所述方法包括将样品、酶混合溶液或冻干酶粉和所述冻干辅助试剂混合进行恒温扩增反应。

56、优选地，使用冻干酶粉。可将酶混合溶液冻干获得冻干酶粉，同样可以配置大量的酶混合溶液，再分装呈单份的量进行冻干。

57、在一些方式中，所述酶混合液或冻干酶粉包含以下的一种或多种物质：dna聚合酶、rna逆转录酶、重组酶、链置换酶、解旋酶、核酸内切酶、核酸外切酶、单链结合蛋白、肌酸激酶、无机焦磷酸酶。

58、在一些方式中，通过酶促重组扩增反应检测草鱼呼肠孤病毒gcrv vp7，所述酶混合溶液组成及最终浓度如下：

59、

60、在一些方式中，通过酶促重组扩增反应检测sars cov 2假病毒，所述酶混合溶液组成及最终浓度如下：

61、

62、

63、在一些方式中，通过酶促重组扩增反应检测嗜水气单胞菌，酶混合溶液组成及最终浓度如下：

64、

65、所述的冻干辅助试剂和酶混合溶液或冻干酶粉可组用于恒温扩增反应的试剂盒。在使用的时候，将冻干辅助试剂、酶混合溶液或冻干酶粉与样本混合即可进行恒温扩增反应。

66、在一些方式中，所述试剂盒还包括样本裂解液，该样本裂解液用于使样本细胞裂解，从而使核酸暴露出来。

67、在一些方式中，所述样本裂解液包含三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化钠和吐温-100，例如50mm三羟甲基氨基甲烷-盐酸、20mm氯化钠和2％吐温-100的混合水溶液。

68、本发明的优势在于，本发明将经过优化的冻干工艺用于核酸恒温扩增反应的缓冲液、激活剂等辅助试剂混合、冻干，获得了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂。该冻干辅助制剂与冻干前的液体试剂具有相同的活性，并且能够常温运输和储存、保质期长，也避免了冻融对辅助试剂活性的影响。另外，所述冻干辅助制剂可按多份量配置，再分装呈单份冻干，配液误差小、使用方便，对反应体系复杂且微量的恒温扩增反应体系具有重要意义。