核酸酶OsPA3及其在提高水稻低磷耐性中的应用

核酸酶ospa3及其在提高水稻低磷耐性中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻核酸酶蛋白ospa3及其在调控水稻根伸长、提高水稻低磷耐性中的应用。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa l.)是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用稻，主要在亚洲、欧洲南部和热带美洲及非洲部分地区。但是其产量受土壤磷素可利用率低的限制。
3.磷(phosphorus,p)在植物体内约占干重的0.05％-1％，是植物细胞膜、细胞质、细胞核的重要组成成分，主要存在于dna、rna、磷脂、腺嘌呤核苷酸(atp、adp及amp)的结构中。由于磷在植物生理生化功能中的重要性，植物对磷的需求量仅次于氮、钾、钙、镁，居第五位。土壤中能被植物直接吸收利用的只有可溶性无机磷酸盐(orthophoaphate,pi)包括h2po
4-、hpo
42-和po
43-。而磷肥施加到土壤中，其中一部分会被快速固定，过量磷肥的施用不仅浪费，还造成了水体富营养化等环境问题。
4.根系是一株植物的全部根的总称，它在植物生长发育过程中起着及其重要的作用，有吸收水分及养分、固定和支撑植株等功能。由于磷在土壤中易被固定而难以移动，通常土壤中磷元素主要通过自由扩散到根际土壤从而被植物吸收。因此，根系的构型决定了植物根系在土壤中所接触的磷的含量。目前已有研究报道了缺磷诱导水稻根系构型的改变，但是其分子机理还有待进一步完善。其中，缺磷引起的根系伸长机理还不明确，且没有相应的技术支撑。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种水稻核酸酶ospa3基因及其在调控水稻根长中的应用，其能在低磷环境中促进水稻根系的生长，提升水稻对低磷的耐性。
6.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.一种水稻核酸酶ospa3基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.进一步地，ospa3基因的核苷酸序列还包括与seq id no.1所示的序列具有85％以上同源性，并编码具有相同功能蛋白的基因。
9.进一步地，ospa3基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.一种工程菌，包括上述ospa3基因。
11.上述ospa3基因在调控水稻根长和提升水稻抗旱性能中的应用。
12.进一步地，ospa3基因在低磷环境中能够促进水稻根的生长。
13.一种促进水稻根生长的试剂，该试剂以上述ospa3基因编码的蛋白作为活性成分；或
14.其包括的活性成分能促进水稻中ospa3基因的表达；使该试剂能在低磷环境中促进水稻根的生长。
rox)，在bio-rad实时荧光定量pcr仪上进行反应。
38.如图1所示，当处于缺磷环境中时，ospa3基因在水稻根部的表达量显著高于正常磷环境。
39.实施例2体外原核表达gst-pa3重组蛋白
40.具体过程如下：
41.1、引物设计
42.在rap-db(https://rapdb.dna/affrc.go.jp)数据库根据ospa3的序列号查询ospa3基因的序列信息，利用网页(https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html)在线设计包含完整开放阅读框在内或包含启动子的具有载体同源臂的引物序列。
43.pgex4t-1-ospa3-bamhi-f：gatctggttccgcgtggatccatggccgcgcgcgtgctc；
44.pgex4t-1-ospa3-noti-r：tcagtcagtcacgatgcggccgcactactctgaaccttgttcccgc；
45.2、扩增
46.以zh11的cdna为模板，pcr反应体系为：2
×
phanta max buffer 12.5μl，dntp mix 0.5μl，cdna 1μl，primer 1μl+1μl，phanta super fidelity dna polymerase 0.5μl，ddh2o to 25μl。
47.pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1kb/1min，循环34次；72℃再延伸5min。
48.在1％琼脂糖凝胶上对pcr扩增产物进行核酸电泳分离，核酸染料染色后在紫外灯下拍照，记录结果，并切胶回收ospa3基因pcr产物。用vwi胶回收试剂盒对电泳条带进行回收。
49.3、酶切回收
50.(1)将pgex4t-1质粒使用vwi质粒提取试剂盒抽提后，使用takara的核酸快切酶进行酶切，然后回收。
51.(2)在1％琼脂糖凝胶上对pcr回收产物及载体酶切回收产物进行核酸电泳分离，核酸染料染色后再紫外灯下拍照记录结果，通过显影的条带亮度与marker对比测量出pcr产物以及载体酶切产物的浓度。
52.4、载体连接
53.(1)使用vazyme的clonexpress ii one step cloning kit对片段和载体进行连接；
54.(2)将连接产物与20μl tiangen的dh5α感受态细胞轻柔混匀，在冰上静置20min，42℃热激1min，冰上静置2min后，添加300μl无抗lb培养液，在37℃摇床复苏培养1h后，涂布菌液于抗性lb平板(含50mg/ml氨苄青霉素)上。于37℃恒温培养箱静置12-16h；
55.(3)于平板上取单菌落进行菌落pcr验证，引物使用pgex4t-1-ospa3-bamhi-f和载体下游反向引物pgex4t-1 reverse，菌落pcr鉴定正确的克隆为携带pgex4t-1-ospa3质粒的dh5α大肠杆菌，将其吸入6ml氨苄抗性lb培养液，37℃摇床培养12-16h；
56.(4)吸1ml菌液加入甘油使终浓度为20％。剩下的菌液以vwi公司提供的highpure plasmid isolation kit试剂盒抽提质粒。
57.(5)抽提出的质粒以1μl进行1％琼脂糖凝胶电泳测浓度，若提出单一目的条带，则
f、pa3-cas-r；
79.pa3-cds-f-301：cacaacacaaacggtgagaagg；
80.zpy-reverse：aacgctgatcaattccacag；
81.pa3-cas-f：ctcttatgcctagtgcgctga；
82.pa3-cas-r：acatcaagctctcggttgga；
83.pcr扩增程序为：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，1min，28x循环，72℃，5min；
84.(5)flag-pa3的pcr扩增结束后采用1％琼脂糖凝胶电泳分离条带并显影鉴定。pa3cas9植株pcr扩增结束后，将pcr产物送北京擎科生物科技有限公司，以pa3-cas-f引物测序。
85.2、rna水平鉴定
86.rna提取及qrt-pcr实验方法同实施例1。
87.3、种子培育
88.(1)将鉴定成功的突变体与过表达种子每个line取40颗置入10ml ep管中，倒入0.7％hno3浸没种子，于室温破休眠18h后换ddh2o，置入28℃恒温培养箱中培养。
89.(2)每日早晚各更换一次管中ddh2o，直至露白；
90.(3)将露白后的种子直接点在ddh2o配置的+pi，-pi营养液上培养，每天记录根长数据；
91.(4)第10天将苗子取出至于浸润湿透的黑布上，旁边放置标签并以相机拍照，结果见图3(图3中a为+pi培养组，b为-pi培养组)。从左往右依次为pa3-1、pa3-2、zh11、flag-pa3-3、flag-pa3-4、flag-pa3-8
92.实施例4 ospa3超表达和突变体生理表型
93.(1)将一周龄幼苗平均分配，先将其全部放置于高磷条件下处理3天，然后分别放置于高磷条件、低磷条件和缺磷条件下处理2周，每周更换水稻营养液，放于温室培养。
94.(2)平铺浸润黑布，再将野生型和突变体材料整齐排列在黑布上，相机拍摄，以photoshop对照片进行裁剪以及添加标尺，结果如图4所示。