一种催化活性提高的L-缬氨酸脱羧酶突变体及其在制备异丁胺中的应用

本发明属于酶工程和基因工程，具体涉及一种催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体及其在制备异丁胺中的应用。

背景技术：

1、异丁胺是一种重要的有机中间体，可用于生产杀虫剂、缓蚀剂和橡胶助剂，在橡胶、石油、医药、农药、染料行业中有广泛的用途。异丁胺可用于合成能有效治疗多种细菌引起感染的抗菌药物盐酸莫西沙星；还可以用于合成地瑞那韦、安普那韦和夫沙那韦一系列抗hiv药物；同时还可以制备成一种合成燃料油。

2、目前工业上主要采用化学法合成异丁胺，采用异丁醇胺化反应合成异丁胺，但是产物存在二异丁胺副产物，分离困难，增加了生产成本。

3、l-缬氨酸脱羧酶是氨基酸脱羧酶的一种，可催化l-缬氨酸脱羧生成异丁胺。

4、现有生产异丁胺的生物合成方法，主要通过梯度启动子调控l-缬氨酸脱羧酶的表达强度来提高异丁胺的合成浓度。如2021年05月28日公布的公布号为cn112852695a的“一株生产异丁胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用”专利，公开的方法是：将l-缬氨酸脱羧酶基因整合至大肠埃希氏菌sval031中，使用启动子和rbs文库调控缬氨酸脱羧酶的表达强度，使异丁胺的产量达到66.4g/l。该方法的主要缺点是：(1)通过梯度启动子和rbs文库来提高l-缬氨酸脱羧酶的表达强度，表达量过高，易形成包涵体，反而导致表达的l-缬氨酸脱羧酶的活性降低。

技术实现思路

1、基于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体，包括该突变体的编码基因，含有该基因的重组载体，以及重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在催化合成异丁胺中的应用。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体，所述突变体是将seq idno.1所示氨基酸序列第209位、第231位、第346位进行单突变或多突变获得的。所述突变体采用定点突变获得。所述seq id no.1所示氨基酸序列编码基因的核苷酸序列为seq idno.2所示。

4、进一步，所述突变体为下列之一：(1)将seq id no.1所示氨基酸序列第209位甘氨酸突变为亮氨酸(g209l，seq id no.3)；(2)将seq id no.1所示氨基酸序列第231位赖氨酸突变为丙氨酸(k231a，seq id no.4)；(3)将seq id no.1所示氨基酸序列第346位色氨酸突变为谷氨酸(w346e，seq id no.5)；(4)将seq id no.1所示氨基酸序列第209位甘氨酸突变为亮氨酸，第231位赖氨酸突变为丙氨酸，第346位色氨酸突变为谷氨酸(g209l/k231a/w346e，seq id no.6)。

5、本发明还提供一种催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体编码基因，由编码基因构建的重组载体，及重组基因工程菌，所述重组载体按如下方法构建：将l-缬氨酸脱羧酶突变体基因插入pet-21a载体的bamhi与saci位点，构建含l-缬氨酸脱羧酶突变体基因的重组质粒。所述工程菌按如下方法制备：将构建的重组质粒转入宿主菌escherichia coli bl21(de3)得到重组工程菌。

6、本发明提供所述l-缬氨酸脱羧酶突变体在催化l-缬氨酸脱羧合成异丁胺中的应用，所述的应用为：以含l-缬氨酸脱羧酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后获得的湿菌体或湿菌体破碎后提取的酶作为生物催化剂，以l-缬氨酸为底物，加入磷酸吡哆醛0.1～2.0mm，以ph为6.5～8.5的缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～45℃、100～300rpm/min条件下进行转化反应，反应结束后，在3500～8000rpm/min条件下进行离心，收集上清。

7、进一步，转化体系中底物的加入总浓度以缓冲液体积计为50～800mm，催化剂的用量以湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为10～25g/l。

8、进一步，湿菌体加入量优先为20g/l。

9、进一步，磷酸吡哆醛的浓度优选为1.0mm。

10、进一步，缓冲液为ph 7.5的pbs缓冲液。

11、进一步，反应温度优选为37℃。

12、进一步，反应结束后，离心条件优选为8000rpm/min。

13、进一步，所述湿菌体在制备方法为：含l-缬氨酸脱羧酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度100mg/l氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm/min条件下震荡培养8～10h，获得种子液。将种子液以1％的接种量接种至新鲜的含有终浓度100mg/l氨苄青霉素的lb液体培养基中，30℃、200rpm下培养至菌体od600达到0.6～0.8，加入终浓度1.0mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，30℃、200rpm下诱导培养10～12h，于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体，用ph为6.5～8.5、50mm的pbs缓冲液重悬、洗涤3次，得到湿菌体。

14、本发明的有益之处在于：本发明通过基于l-缬氨酸脱羧酶晶体结构指导的酶分子半理性设计对l-缬氨酸脱羧酶进行分子改造，获得反应活性提高的突变体，有利于生成目的产物。本发明构建的突变体g209l/k231a/w346e催化l-缬氨酸时，反应的主要产物为异丁胺，异丁胺的产量达到58.8g/l。对l-缬氨酸脱羧酶催化活性的提高使其能够应用于异丁胺的工业化生产，具有重要的意义。

技术特征：

1.一种催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体，其特征在于所述突变体是将seq idno.1所示氨基酸序列第209位、第231、第346位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。

2.如权利要求1所述的催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将seq id no.1所示氨基酸序列的第209位甘氨酸突变为亮氨酸；(2)将seq id no.1所示氨基酸序列的第231位赖氨酸突变为丙氨酸；(3)将seq id no.1所示氨基酸序列的第346位色氨酸突变为谷氨酸；(4)将seq id no.1所示氨基酸序列的第209位甘氨酸突变为亮氨酸，同时将第231位赖氨酸突变为丙氨酸，同时将第346位色氨酸突变为谷氨酸。

3.一种权利要求1所述催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体的编码基因。

4.一种权利要求3所述催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体的编码基因构建的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体在催化l-缬氨酸制备异丁胺中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用以含催化活性提高的l-缬氨酸脱羧酶突变体的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体，湿菌体细胞或湿菌体破碎后提取的纯酶为催化剂，以l-缬氨酸为底物，加入磷酸吡哆醛0.1～2.0mm，以ph为6.5～8.5的pbs缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～45℃、100～300rpm/min条件下进行转化反应，反应结束后，在3500～8000rpm/min条件下进行离心，收集上清，获得异丁胺。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述底物加入总浓度以缓冲液体积计为50～800mm；催化剂的用量以湿菌体重量计，所述湿菌体加入量以缓冲液体积计为10～25g/l。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含l-缬氨酸脱羧酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度100mg/l氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm/min条件下震荡培养8～10h，获得种子液。将种子液以1％的接种量接种至新鲜的含有终浓度100mg/l氨苄青霉素的lb液体培养基中，30℃、200rpm下培养至菌体od600达到0.6～0.8，加入终浓度1.0mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，30℃、200rpm下诱导培养10～12h，于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体，用ph为6.5～8.5、50mm的pbs缓冲液重悬、洗涤3次，得到湿菌体。

技术总结
本发明公开了一种催化活性提高的L‑缬氨酸脱羧酶突变体及其在制备异丁胺中的应用，属于酶工程和基因工程技术领域。本发明的L‑缬氨酸脱羧酶突变体是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第209、第231位、第346位进行单突变或多突变获得的。本发明基于L‑缬氨酸脱羧酶晶体结构指导的酶分子半理性设计，对蛋白质进行分子改造，获得反应活性提高的突变体，有利于生成目的产物。本发明构建的突变体G209L/K231A/W346E催化L‑缬氨酸时，异丁胺的产量达到58.8g/L。对L‑缬氨酸脱羧酶催化活性的提高使其能够应用于异丁胺的工业化生产，具有重要的意义。

技术研发人员：程杰,罗洲,涂文应,曹睿淇,肖书剑,王邦旭,赵兴涛,白婷,张佳敏,王卫
受保护的技术使用者：成都大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15