用于检测猴泡沫病毒的微滴式数字PCR的引物、探针、试剂盒及其方法与流程

本技术属于病原微生物的检测领域，尤其是涉及猴泡沫病毒的检测，具体涉及用于猴泡沫病毒检测的微滴式数字pcr(ddpcr)的引物和探针，以及相关的试剂盒和检测猴泡沫病毒的方法。

背景技术：

1、猴泡沫病毒(simina foamy virus,sfv)属于反转录病毒科、泡沫反转录病毒亚科。在印尼巴厘岛，美国华盛顿大学国家灵长类动物研究中心机构发现亚洲首例sfv，同时发现其自然宿主是非人灵长类动物如恒河猴和黑猩猩。泡沫病毒，有多个血清型，而感染恒河猴的主要是猴泡沫病毒一型。现已在几种灵长类动物体内分离到，包括1型、3型、6型和黑猩猩的猴泡沫病毒。sfv为单正链病毒，是迄今发现的基因组最长的逆转录病毒。wolfe等人对喀麦隆丛林地区的多名猎人进行筛查时,在接触过大猩猩、非洲大拂拂和长尾猴等动物体液的个人的血液中发现一种病毒抗体。由于这种病毒和艾滋病病毒非常相似，传染途径也和艾滋病病毒类似，有专家称其为“准艾滋病病毒”。通过分析比较感染者血液中的病毒基因组序列，发现“准艾滋病病毒”是一种猴泡沫病毒，并第一次证明这种逆转录病毒可以传染给人类，而且在人类宿主中能持续存在。

2、猴泡沫病毒主要存在于非洲、美洲和亚洲，猴可终生无症状携带sfv，经常在接触非人灵长类人群中传播，诱导人类中枢神经的退行性疾病，sfv的感染对人类来说意义重大，有研究人员提出猴泡沫病毒从灵长类动物传染给人的频次比预想的要高，另外猴是常用的模式动物，目前有很多疫苗类生物制品需要用猴的组织细胞，比如：恒河猴肾细胞(rmk)用作脊髓灰质炎减毒活疫苗生产的细胞基质，非洲绿猴肾细胞(vero)用作狂犬疫苗生产的细胞基质，who第49次生物标准化专家委员会会议对脊髓灰质炎疫苗规程作出明确补充，指出用于疫苗生产的猴肾细胞应是来自隔离猴群泡沫病毒抗体阴性的猴体，而猴群中sfv感染率高达70％，为了保证猴群质量，防止sfv在人群中传播，建立有效的sfv检测方法势在必行，同时为生物制品质量提供监测依据。加强实验用猴和猴源性生物制品的病毒检测不仅可以保证疫苗等生物制品的安全性，同时也减少了人类的逆转录病毒感染率。

3、目前，国内外一系列高敏感性的检测方法已用于检测动物的感染状况，以及分析猴源性生物制品如减毒活疫苗的污染情况。技术由于其快速、安全且具有较高敏感性和特异性等优点被广泛应用。任丽虹等人建立了猴血中基因检测方法(任丽虹，白巍，林凌猴血中病毒基因检测方法的建立及应用，中国病毒学)。李华等在评价脊髓灰质炎减毒活疫苗的安全性中，结合此方法对生产用的毒种、半成品及成品糖丸疫苗进行了检测，对保证疫苗的安全具有重要意义。近年来，微滴式数字pcr技术已经商业化，将反应分为纳米级别大小的液滴。数千个液滴的快速微流体分析每个样品使ddpcr适用于常规使用，并大大提高了系统的实际动态范围(对每个液滴的多个目标分子进行泊松校正)。该技术比qpcr相比具有许多潜在的优势，具有较高的灵敏度和精密度，并正以一种有效的独立dna定量方法迅速取代qpcr，在过往的研究中，贺争鸣等人建立了猴泡沫病毒的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒，任丽虹等人建立了猴血中sfv病毒基因巢式pcr方法。但至今为止，尚未建立猴泡沫病毒微滴式数字pcr方法。

技术实现思路

1、本发明的一个方面涉及用于检测猴泡沫病毒的微滴式数字pcr的引物和探针，其中，

2、上游引物核苷酸序列为：5’-tggtctcctkytgtwggc-3’(seq id no:1)，

3、下游引物核苷酸序列为：5’-tgttgccaagatggtccaaaa-3’(seq id no:2)，

4、探针核苷酸序列为：5’-cgaccacgbtggcataarcct-3’(seq id no:3)，5’端带有荧光基团，3’端带有荧光淬灭基团；

5、所述引物和探针靶向目的基因为猴泡沫病毒pol基因。

6、本发明第二个方面涉及用于检测猴泡沫病毒的微滴式数字pcr的试剂盒，其包含，

7、上游引物，其核苷酸序列为：5’-tggtctcctkytgtwggc-3’(seq id no:1)；

8、下游引物，其核苷酸序列为：5’-tgttgccaagatggtccaaaa-3’(seq id no:2)；

9、探针，其核苷酸序列为：5’-cgaccacgbtggcataarcct-3’(seq id no:3)，5’端带有荧光基团，3’端带有荧光淬灭基团。

10、本发明的某些实施方案中，探针为

11、5’-fam-cgaccacgbtggcataarcct-tamra-3’。

12、本发明某些具体实施方案中，其进一步包含阳性质控品，其中所述阳性质控品为包含猴泡沫病毒pol基因序列的质粒。

13、本发明某些具体实施方案涉及的用于检测猴泡沫病毒的微滴式数字pcr的试剂盒，其进一步包含ddpcr预混液、和/或反应耗材及说明书；所述ddpcr预混液包含dna聚合物、dntp和反应缓冲液。

14、本发明另外的方面涉及一种检测猴泡沫病毒的方法，此方法采用微滴式数字pcr，其中，

15、上游引物核苷酸序列为：5’-tggtctcctkytgtwggc-3’(seq id no:1)，

16、下游引物核苷酸序列为：5’-tgttgccaagatggtccaaaa-3’(seq id no:2)，

17、探针核苷酸序列为：5’-cgaccacgbtggcataarcct-3’(seq id no:3)，5’端带有荧光基团，3’端带有荧光淬灭基团。

18、本发明涉及的的检测猴泡沫病毒的方法，其包括如下步骤，

19、步骤1，提取待测猴组织的基因组dna；

20、步骤2，根据反应体系，将步骤1所得的基因组dna、引物和探针以及ddpcr预混液混合，以放入ddpcr检测上进行扩增反应；

21、步骤3，将反应结束的ddpcr芯片放入阅读仪或扫描仪以完成荧光信号检测，并且利用软件完成拷贝数统计。

22、本发明具体实施方案中，其包含同时设置阳性质控品和/或阴性质控品。

23、所述的检测猴泡沫病毒的方法，其反应体系为：

24、pcr预混液：12.5μl；

25、上下游引物(20μm)：各1.0μl；

26、探针(20μm)：0.3μl；

27、rnase-free ddh2o：5.2μl；

28、基因组dna：5μl；

29、共计25μl。

30、所述的检测猴泡沫病毒的方法，其反应程序为

31、95℃15min；

32、94℃30s，60℃退火1min，72℃30s，共40个循环；

33、98℃10min；

34、20℃2min保持；

35、反应温度升降速率<2.0℃/s。