α-酮戊二酸脱氢酶检测试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种α-酮戊二酸脱氢酶(α-kgdh)检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.α-酮戊二酸脱氢酶(α-kgdh)是微生物细胞中三羧酸循环(tca cycle)重要的代谢中间产物，环境中的碳源物质转运进入细胞内后，经过糖酵解形成丙酮酸(pyruvate)，以丙酮酸形式进入tca循环的碳源物质依次在丙酮酸脱氢酶系(pdhc)、柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶作用下形成α-kgdh，α-kgdh在酮戊二酸脱氢系(kgdh)的作用下进一步代谢成琥珀酰-coa，进入下一个碳代谢节点，在这一过程中伴随着电子传递和能量产生，为细胞的生长繁殖提供碳源物质和能量。除此之外，α-kgdh还经转氨基作用形成l-谷氨酸进入氮代谢中，所以α-kgdh是连接碳代谢和氮代谢的重要代谢中间物。
3.目前市面上α-kgdh检测试剂盒中的提取液含有蛋白，在检测过程中还需要格外进行提取液中蛋白浓度检测，操作麻烦，对α-kgdh的实验结果有影响，容易造成实验不稳定，重复性差。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种α-酮戊二酸脱氢酶(α-kgdh)检测试剂盒及其应用方法，该试剂盒不含蛋白，检测灵敏度高，并且可以实现简化优化检测操作方法，重复性好。
5.本发明采用如下技术方案：
6.本发明提供一种不含蛋白的α-酮戊二酸脱氢酶检测试剂盒，所述试剂盒包括：
7.试剂一，主要由甘露醇、蔗糖、egta、曲拉通和hepes组成的ph为7.4的溶液。
8.试剂二，pmsf溶液。
9.试剂三，ph为7.4的tris-hcl缓冲液。
10.试剂四，包括mgcl2和酮戊二酸。
11.试剂五，鱼藤酮溶液。
12.试剂六，包括tpp和辅酶a。
13.试剂七，nad。
14.在其中一些实施例中，mgcl2、酮戊二酸、tpp、辅酶a和nad的重量比为2～8:1～6:1～3:0.01～1.5:5～15，更优选为4.2:3:2:0.78:9.2。
15.在其中一些实施例中，所述试剂一中，甘露醇的浓度为0.01～2m(优选1m)，蔗糖的浓度为0.01～1m(优选0.35m)，egta的浓度为1～10mm(优选5mm)，曲拉通的浓度为0.1～2％(优选1％)，hepes的浓度为20～80mm(优选50mm)。
16.在其中一些实施例中，pmsf溶液的浓度为50～200mm，优选100mm。
17.在其中一些实施例中，鱼藤酮的浓度为1～4mg/ml，优选2mg/ml。
18.在其中一些实施例中，所述的α-酮戊二酸脱氢酶检测试剂盒由如下成分组成：试
剂一，ph为7.4的液体100ml，由1m甘露醇、0.35m蔗糖、5mm egta、1％曲拉通和50mm hepes组成；试剂二，100mm pmsf溶液1.5ml；试剂三，ph为7.4的40mm tris-hcl缓冲液18ml；试剂四，由4.2mg mgcl2和3mg酮戊二酸组成的粉剂；试剂五，2mg/ml鱼藤酮25μl；试剂六，由2mg tpp和0.78mg辅酶a组成的粉剂；试剂七，9.2mg的nad。
19.本发明提供上述α-酮戊二酸脱氢酶检测试剂盒在利用微量法检测α-酮戊二酸脱氢酶中的应用。所述α-酮戊二酸脱氢酶检测试剂盒可用于充分分离胞浆蛋白和线粒体蛋白中的α-酮戊二酸脱氢酶。
20.本发明还可以提供一种α-酮戊二酸脱氢酶的微量检测方法，利用上述α-酮戊二酸脱氢酶检测试剂盒，包括如下步骤：将试剂四、试剂五、试剂六转移到试剂三中，充分溶解待用，形成工作液；向试剂七中加入1ml去离子水，形成nad溶液；称取动物组织1g或者500万细胞，加入1ml试剂一和10μl试剂二，匀浆，离心得上清待测样品；测定孔加入上清待测样品10μl，再分别加入180μl工作液和10μlnad溶液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值a1，37℃准确反应2min，记录2min20 s后的吸光值a2，计算δa测定＝a2-a1；空白孔加入去离子水10μl，再分别加入180μl工作液和10μlnad溶液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值a1，37℃准确反应2min，记录2min20 s后的吸光值a2，计算δa空白＝a2-a1；
21.按样本蛋白浓度计算α-酮戊二酸脱氢酶的酶活：
22.单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的nadh定义为一个酶活力单位。
23.α-kgdh(u/mg prot)＝[(δa测定-δa空白)
÷
(ε
×
d)
×
v反总
×
109]
÷
(v样
×
cpr)
÷
t＝3215.43
×
(δa测定-δa空白)
÷
cpr
[0024]
按样本质量计算α-酮戊二酸脱氢酶的酶活：
[0025]
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的nadh定义为一个酶活力单位。
[0026]
α-kgdh(u/g质量)＝[(δa测定-δa空白)
÷
(ε
×
d)
×
v反总
×
109]
÷
(v样
÷
v样总
×
w)
÷
t＝3247.59
×
(δa测定-δa空白)
÷w[0027]
按细胞数量计算α-酮戊二酸脱氢酶的酶活：
[0028]
单位的定义：每1万个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的nadh定义为一个酶活力单位。
[0029]
α-kgdh(u/104cell)＝[(δa测定-δa空白)
÷
(ε
×
d)
×
v反总
×
109]
÷
(v样
÷
v样总
×
500)
÷
t＝6.50
×
(δa测定-δa空白)
[0030]
其中，v反总：反应体系总体积，2
×
10-4
l；ε：nadh摩尔消光系数，6.22
×
103l/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；v样：加入样本体积，0.01ml；v样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；t：反应时间，2min；cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；w：样本质量，g；500：细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol＝109nmol。
[0031]
在其中一些实施例中，所述的α-酮戊二酸脱氢酶的检测方法还包括预先将工作液置于25℃或者37℃孵育中预热的步骤。
[0032]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0033]
本发明α-kgdh检测试剂盒采用nad、tpp、辅酶a、酮戊二酸、甘露醇、蔗糖、egta、hepes、pmsf、鱼藤酮等以特定比例组装，能够有效分离胞浆蛋白和线粒体蛋白，提取液中不
含蛋白，检测灵敏度高，并且可以实现简化优化检测操作方法，重复性好，准确度高。
具体实施方式
[0034]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
[0035]
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
[0036]
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0037]
本发明可以提供一种不含蛋白的α-酮戊二酸脱氢酶检测试剂盒，包括：试剂一：主要由甘露醇、蔗糖、egta、曲拉通和hepes组成的ph为7.4的溶液。
[0038]
试剂二：pmsf溶液。
[0039]
试剂三：ph为7.4的tris-hcl缓冲液。
[0040]
试剂四：包括mgcl2和酮戊二酸。
[0041]
试剂五：鱼藤酮溶液。
[0042]
试剂六：包括tpp和辅酶a。
[0043]
试剂七：nad。
[0044]
本发明采用nad、tpp、辅酶a、酮戊二酸、甘露醇、蔗糖、egta、hepes、pmsf、鱼藤酮复配，整体上能够有效分离胞浆蛋白和线粒体蛋白，提取液中不含蛋白，检测灵敏度高，并且可以实现简化优化检测操作方法，重复性好，准确度高。
[0045]
下面举例说明：
[0046]
实施例1
[0047]
本实施例提供一种α-酮戊二酸脱氢酶(α-kgdh)检测试剂盒，其试剂组成如下表所示：
[0048]
[0049][0050]
实施例2
[0051]
本实施例提供实施例1的α-酮戊二酸脱氢酶(α-kgdh)检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0052]
s1，配制工作液：
[0053]
将试剂四、试剂五、试剂六溶解到试剂三中，形成工作液。
[0054]
将试剂七溶解到1ml去离子水中，形成nad溶液。
[0055]
s2，制备待测样品溶液：
[0056]
准确称取0.1g小鼠肝脏组织，加入1ml试剂一和10μl试剂二，冰浴用匀浆器或研钵匀浆。4℃，11000g离心10min，取上清，置冰上待测。
[0057]
s3，检测340nm处的吸光度值：
[0058]
将酶标仪预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
[0059]
工作液置于37℃孵育10min；在96孔uv板中，测定孔加入10μl上清样本，空白孔加入10μl去离子水，再分别加入180μl工作液和10μl试剂七溶液(nad水溶液)，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值a1，37℃准确反应2min，记录2min20 s后的吸光值a2，计算测定孔δa测定＝a2-a1和空白孔δa空白＝a2-a1；
[0060]
s4，按样本鲜重计算α-kgdh的酶活：
[0061]
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的nadh定义为一个酶活力单位。
[0062]
α-kgdh(u/g质量)＝[(δa测定-δa空白)
÷
(ε
×
d)
×
v反总
×
109]
÷
(v样
÷
v样总
×
w)
÷
t＝3247.59
×
(δa测定-δa空白)
÷w[0063]
v反总：反应体系总体积，2
×
10-4
l；ε：nadh摩尔消光系数，6.22
×
103l/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；v样：加入样本体积，0.01ml；v样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；t：反应时间，2min；w：样本质量，g；109：单位换算系数，1mol＝109nmol。
[0064]
实施例3
[0065]
本实施例提供实施例1的α-酮戊二酸脱氢酶(α-kgdh)检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0066]
s1，配制工作液：
[0067]
将试剂四、试剂五、试剂六溶解到试剂三中，形成工作液。
[0068]
将试剂七溶解到1ml去离子水中，形成nad溶液。
[0069]
s2，制备待测样品溶液：
[0070]
收集500万hek293细胞，加入1ml试剂一和10μl试剂二，冰浴用匀浆器或研钵匀浆。4℃，11000g离心10min，取上清，置冰上待测。
[0071]
s3，检测340nm处的吸光度值：
[0072]
将酶标仪预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
[0073]
工作液置于37℃孵育10min；在96孔uv板中，测定孔加入10μl上清样本，空白孔加入10μl去离子水，再分别加入180μl工作液和10μl试剂七溶液(nad水溶液)，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值a1，37℃准确反应2min，记录2min20 s后的吸光值a2，计算测定孔δa测定＝a2-a1和空白孔δa空白＝a2-a1；
[0074]
s4，按细胞密度计算α-kgdh的酶活：
[0075]
单位的定义：每1万个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的nadh定义为一个酶活力单位。
[0076]
α-kgdh(u/104cell)＝[(δa测定-δa空白)
÷
(ε
×
d)
×
v反总
×
109]
÷
(v样
÷
v样总
×
500)
÷
t＝6.50
×
(δa测定-δa空白)
[0077]
v反总：反应体系总体积，2
×
10-4
l；ε：nadh摩尔消光系数，6.22
×
103l/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；v样：加入样本体积，0.01ml；v样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；t：反应时间，2min；500：细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol＝109nmol。
[0078]
对比例为市售试剂盒(工作液配制比较麻烦，市售试剂盒样本量12ul+工作液200ul)。
[0079]
与市售试剂盒区别是：本发明提取液没有蛋白，样本和工作液的体积量更少，节省原料和成本。
[0080]
实施例2和3的α-kgdh测试结果见下表：
[0081]
表1 α-kgdh含量比较[n＝5，x
±
s]
[0082][0083]
由上表测试结果可以看出，采用实施例1制备的α-kgdh检测试剂盒检测组织或者细胞中的α-kgdh含量的准确度更高，灵敏度更高。
[0084]
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。