一种得到具有生物有机肥功能的极端生境菌株的方法及菌剂复配工艺

一种得到具有生物有机肥功能的极端生境菌株的方法及菌剂复配工艺
1.本技术是申请日为2021年08月12日、申请号为202110923576.5、发明名称为《一种极端生境生物有机肥菌株筛选方法及菌剂复配工艺》的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物有机肥领域，具体涉及一种得到具有生物有机肥功能的极端生境菌株的方法及菌剂复配工艺。


背景技术：

3.生物有机肥是指特定功能微生物与主要以动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸秆等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。畜禽粪便、农作物秸秆、城镇生活垃圾以及园林植物废弃物是干扰世界环境和人们健康的直接来源。又由于长期不合理的使用化学肥料，造成部分农田营养成分比例失调，导致农田生态环境、土壤理化特性和区系土壤微生物受到不同程度的破坏，在一定程度上危及到农产品的安全和人们的生活质量。而生物有机肥不仅提供植物生长所需要养分，补充土壤区系微生物的同时，还能有效的改良土壤板结、防止土壤盐碱化、减少化肥用量等特点。因此，生物有机肥在实现世界环境与生态可持续发展方面发挥重要的作用。
4.生物有机肥目前多采用自然条件下或加入腐熟菌剂的堆肥发酵，在对畜禽粪便、农作物秸秆等堆肥时，需加入腐熟用的生产菌株，可以有效的缩短发酵腐熟周期，提高生产效率；但是通常这些生产菌株均需要在适宜的温度、湿度等环境条件满足的情况下才可以实施，对于高海拔地区、高纬度的地区、西北干燥地区，环境恶劣，常见生物有机肥发酵菌剂通常只能在15℃以上才能启动发酵，而且由于外界温差较大，需要保持大型t字型堆体，一般为底部3米宽顶部2米宽，高度2米，低于15摄氏度，生物有机肥企业不能正常生产。因此，亟待研究一种得到具有生物有机肥功能的极端生境菌株的方法及菌剂复配工艺。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题就是克服以上的技术缺陷，提供一种得到具有生物有机肥功能的极端生境菌株的方法及菌剂复配工艺。
6.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供的技术方案为一种得到具有生物有机肥功能的极端生境菌株的方法，包括下列步骤：
8.s1：菌种选取，在自然环境温度-23℃的极端生境下，从禽畜养殖场粪土堆底部土壤中采集土壤样本，取10g土壤样本过20目筛，加入90毫升灭菌水搅拌制成土壤悬液，通过梯度稀释法，将土壤悬液稀释至105～107倍，分别将105～107稀释液涂布于培养皿内；
9.s2：菌种培养，将s1步骤中涂抹了土壤悬液的培养皿置于35-39℃恒温箱内恒温暗光培养，每天通过显微镜观察并记录生长状况，扩大培养5-9天；
10.s3：菌种测序，分别将s2中培养的各种菌种进行16srrna基因测序，并将测序结果与blast对比；
11.s4：菌种分离，去除致病菌种，筛选得到目标菌株，分别为特基拉芽孢杆菌gsicc30298(序列如seqidno.1所示)、特基拉芽孢杆菌gsicc32846(序列如seqidno.2所示)、蜡样芽孢杆菌gsicc30299(序列如seqidno.3所示)、苏云金芽孢杆菌gsicc32845(序列如seqidno.4所示)、贝莱斯芽孢杆菌gsicc32847(序列如seqidno.5所示)。
12.优选的，所述培养皿内为pda培养基。
13.本发明还提供了一种极端生境生物有机肥菌株的菌剂复配工艺，包括以下步骤：
14.s1：材料准备，土样收集，在冬季气温寒冷时收集土样1和土样2；土样1，按照权利要求1中s1的方法收集土样1，并涂抹于培养皿中；土样2，于未开发利用的荒地采集土样2，过筛、制作土壤悬液并涂抹于另一培养皿中；
15.培养基制备，无机氮基本培养基：nh4h2po41g，kno31g，(nh4)2so40.5g，k2hpo41g，nacl5g，mgso40.2g，琼脂粉20g和蒸馏水1000ml，ph自然；
16.培养基1：基本培养基+葡萄糖(每升培养基中含碳量为15mg)；
17.培养基2：基本培养基+蔗糖(每升培养基中含碳量为15mg)；
18.培养基3：基本培养基+柠檬酸(每升培养基中含碳量为15mg)；
19.培养基4：nh4h2po40.2g，mgso40.2g，nacl0.2g，caso40.2g，caco35g，葡萄糖(每升培养基中含碳量为15mg)，琼脂粉11g和蒸馏水1000ml，ph7.0-7.2；
20.s2：菌株的分离纯化，采用梯度稀释法，将两种土样经过无菌生理盐水稀释后，分别涂布于上述培养基中，在37℃下培养，待菌落长出后分别挑取单菌落，分离纯化后保藏，土样1中得到如权利要求1中s4步骤中的目标菌株；
21.s3：菌株低营养环境的生长研究，将筛选出的菌株分别接种到不同稀释倍数(稀释倍数为10、100、1000、10000倍)的牛肉膏蛋白胨培养基中，接种量均为106cfu/ml，在相同的条件下培养，每隔一段时间检测活菌数，观察菌数在不同浓度稀释培养基中的变化，筛选出低营养菌株；
22.s4：菌种鉴定，提取筛选出低营养菌株dna，采用16srrna特异区进行pcr，产物送测后blast比对，鉴定出各菌株种属；
23.s5：菌株理化特性研究，对分离出的低营养菌株在不同ph值、温度，不同碳源、氮源进行研究，为菌株中试生产降低成本提供理论数据；
24.s6：菌株功能性研究，对分离出的低营养菌株分泌吲哚乙酸、溶磷解钾、acc脱氨酶活性及固氮能力等进行测定，明确菌株对植物的促生效应；
25.s7：菌株复配，将两个土样中取得的目标菌株交叉组合，检测菌株之间的拮抗作用，根据菌株在低营养条件下的生长情况、菌株理化性质的区别以及菌株功能性特点，选择发酵启动温度低的菌株复配组合，在中试工艺中优化组合比例，最终形成一种低营养低温发酵启动的生物有机肥发酵复配菌剂生产工艺。
26.本发明与现有技术相比的优点在于：1、从极端环境-23℃温度下分离获得微生物，同时又能在营养胁迫下正常生长，经过16srrna特异区鉴定，共得到可以用于生物有机肥发酵菌株5株；2、筛选得到的5株微生物菌株，经过理化性质及功能性研究后进行复配，形成低温环境发酵的生物有机肥生产用微生物菌剂制剂；3、筛选自低温低营养的5株微生物菌
株，分离于牛粪堆体与土壤交界处，经分子生物学鉴定为有益菌，在营养充分时，5株微生物均可在-23℃逐步启动牛粪发酵，促进堆体升温，有利于牛粪在低温环境下发酵。
附图说明
27.图1是蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)菌种培养图；
28.图2是苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)菌种培养图；
29.图3是贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌种培养图；
30.图4是特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)菌种培养图；
31.图5是特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)菌种培养图。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
33.实施例一：一种极端生境生物有机肥菌株筛选方法，包括下列步骤：
34.s1：菌种选取，在自然环境温度-23℃的极端生境下，从禽畜养殖场粪土堆底部土壤中采集土壤样本，取10g土壤样本过20目筛，加入90毫升灭菌水搅拌制成土壤悬液，通过梯度稀释法，将土壤悬液稀释至105～107倍，分别将105～107稀释液涂布于培养皿内；
35.s2：菌种培养，将s1步骤中涂抹了土壤悬液的培养皿置于35℃恒温箱内恒温暗光培养，每天通过显微镜观察并记录生长状况，扩大培养5天；
36.s3：菌种测序，分别将s2中培养的各种菌种进行16srrna基因测序，并将测序结果与blast对比；
37.s4：菌种分离，去除致病菌种，筛选得到目标菌株，分别为特基拉芽孢杆菌gsicc30298(序列如seqidno.1所示)、特基拉芽孢杆菌gsicc32846(序列如seqidno.2所示)、蜡样芽孢杆菌gsicc30299(序列如seqidno.3所示)、苏云金芽孢杆菌gsicc32845(序列如seqidno.4所示)、贝莱斯芽孢杆菌gsicc32847(序列如seqidno.5所示)。
38.进一步的，所述培养皿内为pda培养基。
39.一种极端生境生物有机肥菌株的菌剂复配工艺，包括以下步骤：
40.s1：材料准备，土样收集，在冬季气温寒冷时收集土样1和土样2；土样1，按照权利要求1中s1的方法收集土样1，并涂抹于培养皿中；土样2，于未开发利用的荒地采集土样2，过筛、制作土壤悬液并涂抹于另一培养皿中；
41.培养基制备，无机氮基本培养基：nh4h2po41g，kno31g，(nh4)2so40.5g，k2hpo41g，nacl5g，mgso40.2g，琼脂粉20g和蒸馏水1000ml，ph自然；
42.培养基1：基本培养基+葡萄糖(每升培养基中含碳量为15mg)；
43.培养基2：基本培养基+蔗糖(每升培养基中含碳量为15mg)；
44.培养基3：基本培养基+柠檬酸(每升培养基中含碳量为15mg)；
45.培养基4：nh4h2po40.2g，mgso40.2g，nacl0.2g，caso40.2g，caco35g，葡萄糖(每升培养基中含碳量为15mg)，琼脂粉11g和蒸馏水1000ml，ph7.0-7.2；
46.s2：菌株的分离纯化，采用梯度稀释法，将两种土样经过无菌生理盐水稀释后，分别涂布于上述培养基中，在37℃下培养，待菌落长出后分别挑取单菌落，分离纯化后保藏，土样1中得到如权利要求1中s4步骤中的目标菌株；
47.s3：菌株低营养环境的生长研究，将筛选出的菌株分别接种到不同稀释倍数(稀释倍数为10、100、1000、10000倍)的牛肉膏蛋白胨培养基中，接种量均为106cfu/ml，在相同的条件下培养，每隔一段时间检测活菌数，观察菌数在不同浓度稀释培养基中的变化，筛选出低营养菌株；
48.s4：菌种鉴定，提取筛选出低营养菌株dna，采用16s rrna特异区进行pcr，产物送测后blast比对，鉴定出各菌株种属；
49.s5：菌株理化特性研究，对分离出的低营养菌株在不同ph值、温度，不同碳源、氮源进行研究，为菌株中试生产降低成本提供理论数据；
50.s6：菌株功能性研究，对分离出的低营养菌株分泌吲哚乙酸、溶磷解钾、 acc脱氨酶活性及固氮能力等进行测定，明确菌株对植物的促生效应；
51.s7：菌株复配，将两个土样中取得的目标菌株交叉组合，检测菌株之间的拮抗作用，根据菌株在低营养条件下的生长情况、菌株理化性质的区别以及菌株功能性特点，选择发酵启动温度低的菌株复配组合，在中试工艺中优化组合比例，最终形成一种低营养低发酵启动温度的生物有机肥发酵复配菌剂生产工艺。
52.实施例二：一种极端生境生物有机肥菌株筛选方法，包括下列步骤：
53.s1：菌种选取，在外界环境温度-23℃的极端生境下，从禽畜养殖场粪土堆底部土壤中采集土壤样本，取10g土壤样本过20目筛，加入20毫升灭菌水搅拌制成土壤悬液，将土壤悬液涂抹于培养皿内；
54.s2：菌种培养，将s1步骤中涂抹了土壤悬液的培养皿置于39℃恒温箱内恒温暗光培养，每天通过显微镜观察并记录生长状况，扩大培养9天；
55.s3：菌种测序，分别将s2中培养的各种菌种进行基因测序，并将测序结果与数据库对比；
56.s4：菌种分离，去除致病菌种，筛选得到目标菌株，分别为特基拉芽孢杆菌gsicc30298(序列如seq id no.1所示)、特基拉芽孢杆菌 gsicc32846(序列如seq id no.2所示)、蜡样芽孢杆菌gsicc30299(序列如 seq id no.3所示)、苏云金芽孢杆菌gsicc32845(序列如seq id no.4所示)、贝莱斯芽孢杆菌gsicc32847(序列如seq id no.5所示)。
57.实施例三：一种极端生境生物有机肥菌株筛选方法，包括下列步骤：
58.s1：菌种选取，在外界环境温度-23℃的极端生境下，从禽畜养殖场粪土堆底部土壤中采集土壤样本，取10g土壤样本过20目筛，加入15毫升灭菌水搅拌制成土壤悬液，将土壤悬液涂抹于培养皿内；
59.s2：菌种培养，将s1步骤中涂抹了土壤悬液的培养皿置于37℃恒温箱内恒温暗光培养，每天通过显微镜观察并记录生长状况，扩大培养7天；
60.s3：菌种测序，分别将s2中培养的各种菌种进行基因测序，并将测序结果与数据库对比；
61.s4：菌种分离，去除致病菌种，筛选得到目标菌株，分别为特基拉芽孢杆菌gsicc30298(序列如seq id no.1所示)、特基拉芽孢杆菌 gsicc32846(序列如seq id no.2
所示)、蜡样芽孢杆菌gsicc30299(序列如 seq id no.3所示)、苏云金芽孢杆菌gsicc32845(序列如seq id no.4所示)、贝莱斯芽孢杆菌gsicc32847(序列如seq id no.5所示)。
62.特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)，培养基组成：lb培养基：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，nacl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1.0l，ph 7.0；特征特性：菌株在lb培养基上菌落边缘光滑湿润，不透明，呈微黄色；保藏方法：-80℃超低温冻结，真空冷冻干燥，保护剂50％甘油。
63.蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)，培养基组成：lb培养基：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，nacl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1.0l，ph 7.0；特征特性：菌株在lb培养基上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙。保藏方法：-80℃超低温冻结，真空冷冻干燥，保护剂50％甘油。
64.苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)，培养基组成：lb培养基：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，nacl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1.0l，ph 7.0；特征特性：菌株在lb培养基上菌落为圆形或者椭圆形，边缘不规则，不透明微隆起。保藏方法：-80℃超低温冻结，真空冷冻干燥，保护剂50％甘油。
65.特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)，培养基组成：lb培养基：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，nacl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1.0l，ph 7.0；特征特性：菌株在lb培养基上菌落边缘光滑湿润，不透明，呈微黄色。保藏方法：-80℃超低温冻结，真空冷冻干燥，保护剂50％甘油。
66.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，培养基组成：lb培养基：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，nacl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1.0l，ph 7.0；特征特性：菌株在lb培养基上菌落边缘不规则，菌落较大。保藏方法：-80℃超低温冻结，真空冷冻干燥，保护剂50％甘油。
67.以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，具体实施方式中所示的也只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。