用于检测呼吸道腺病毒7型的特异性引物和探针及其应用的制作方法

1.本发明属于分子生物学诊断技术领域，涉及快速检测呼吸道腺病毒7型的荧光定量pcr方法的引物与探针组合，及利用该组合来快速鉴定呼吸道腺病毒7型的应用。


背景技术：

2.1954年在急性呼吸道感染患者的咽喉洗液中分离到相同病毒，命名为人腺病毒。致病性腺病毒可感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等，并引起广泛的临床症状，但呼吸道腺病毒更为常见，其中可导致呼吸道感染的腺病毒包括腺病毒3型、7型、11型、14型、21型、55型等，主要集中在b亚属，b亚属分为两个亚种，分别命名为b1(腺病毒3型、7型、16型、21型和50型)和b2(腺病毒11型、14型、34型和35型)，其中3型、4型、7型、14型为最常见的引起暴发疫情的型别，曾引起我国江苏和台湾地区，以及韩国、新加坡、马来西亚等呼吸道腺病毒暴发疫情，呼吸道腺病毒对公众健康构成了巨大的威胁。其中，腺病毒7型是引起学校和军营发生暴发性流行性呼吸道感染的主要病原体之一，主要集中于冬春季节。临床表现为发热、鼻塞、流涕、咽痛和周身乏力等，继之出现咳嗽、咳痰，部分患者出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等消化道症状。
3.目前呼吸道腺感染的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，如聚合酶链反应和实时定量聚合酶链反应。当前酶联免疫检测技术现在已经足够成熟，并广泛应用于呼吸道腺病毒的快速诊断。目前商用的呼吸道腺病毒7型检测试剂盒主要包括用于检测病毒核蛋白抗原的酶联免疫分析法，但由于受方法学限制，其灵敏度尚未达到理想要求。因而开发一种快速、灵敏、有效的呼吸道腺病毒7型检测产品势在必行，这能促进更早更广泛的发现呼吸道腺病毒7型感染，控制疫情扩散。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一组针对呼吸道腺病毒7型hexon基因的特异性引物和探针，能特异性检测呼吸道腺病毒。
5.本发明的第二个目的提供一种呼吸道腺病毒7型荧光定量pcr检测试剂盒，具有特异性好、灵敏度高、准确性好、检测速度快、操作简便等特点。通过以下步骤和技术方案实现：
6.设计特异性引物与探针：根据呼吸道腺病毒hexon基因保守区域设计了一组针对呼吸道腺病毒7型hexon基因的检测引物与探针，包括两条引物和一条探针，序列分别是：
7.上游引物：adv-f：5
’‑
cgccaggtggtctcttgac-3’(seq id no.1)，
8.下游引物：adv-r：5
’‑
cgtaggtgtaggagccaggta-3’(seq id no.2)；
9.探针：adv-p：5
’‑
fam-ccattcaaccaccaccgc-mgb-3’(seq id no.3)，adv-p的5’端进行报告荧光染料fam标记，3’端进行荧光淬灭基团mgb标记。
10.呼吸道腺病毒7型荧光定量pcr检测试剂盒(探针法)包含两条引物和一条探针，序列分别是：
11.上游引物：h4-f：5
’‑
gacccarggatacaaggaca-3’(seq id no.1)，
12.下游引物：h4-r：5
’‑
aaatgcaaatctggcacc-3’(seq id no.2)；
13.探针：h4-p：5
’‑
cy5-ttgtgggcttgtc-mgb-3’(seq id no.3)，h4-p的5’端进行报告荧光染料cy5标记，3’端进行荧光淬灭基团mgb标记。
14.试剂盒还包括荧光定量pcr反应缓冲液、荧光定量pcr反应混合酶和无核酸酶水。
15.具体的，呼吸道腺病毒7型荧光定量pcr检测试剂盒(探针法)包括：
[0016][0017]
总反应体系为25微升，其中模板可以为阳性对照、阴性对照或待检样本。
[0018]
呼吸道腺病毒7型荧光定量pcr检测试剂盒(探针法)的检测方法如下：
[0019]
1)利用核酸提取试剂从待测样本中提取dna。
[0020]
2)利用检测试剂盒中提供的引物与探针、荧光定量pcr反应缓冲液、荧光定量pcr反应混合酶和无核酸酶水进行荧光定量pcr反应，扩增核酸。
[0021]
3)荧光定量pcr反应扩增条件：第一阶段，预变性：95摄氏度，2分钟；第二阶段，pcr扩增：95摄氏度，5秒；60摄氏度，30秒，45个循环，每次循环第二阶段60摄氏度扩增后采集荧光信号，选择荧光通道fam。
[0022]
4)根据ct值判断荧光定量pcr检测结果，判定样品中是否含有呼吸道腺病毒7型。
[0023]
本发明的另一个目的是提供含检测呼吸道腺病毒7型的特异性引物和探针的特异性检测试剂盒，在含有呼吸道腺病毒的人体样本中的检测。
[0024]
本发明公开一种快速检测呼吸道腺病毒7型的一对特异性引物和探针组合，同时提供包括特异性引物和探针的荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)检测试剂盒(探针法)。本发明提供的试剂盒，使用呼吸道腺病毒病毒7型hexon基因特异性引物和探针通过荧光定量pcr快速检测呼吸道腺病毒7型，反应在一管内完成，操作方便，并降低了污染风险，实现呼吸道腺病毒7型的快速检测。经实验证明，该荧光定量pcr试剂盒对呼吸道腺病毒7型具有良好的特异性、敏感性和重复性，为临床诊断腺病毒疫情早期预警机制提供了可行的技术支持。
[0025]
本发明具有操作简单、检测时间短、特异性强、准确率高等优点。本发明为临床样本中呼吸道腺病毒病毒7型感染的辅助诊断提供了有效的工具，并可推广应用于临床和实验研究。
[0026]
说明书附图
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图1为呼吸道腺病毒7型荧光定量pcr检测试剂盒的特异性。
[0028]
图2为呼吸道腺病毒7型荧光定量pcr检测试剂盒的灵敏度。
拷贝每微升)，并进行荧光定量pcr检测。结果显示：本发明的荧光定量pcr方法的检测限为10拷贝每微升，具有较高的灵敏度。
[0045]
结果见附图2。
[0046]
(7)评估荧光定量pcr试剂盒检测呼吸道腺病毒7型的重复性：
①
使用三个不同浓度的dna质粒模板(106、104、102拷贝每微升)，在一次实验中设置三个复孔以评估荧光定量pcr试剂盒的批内差异。
②
使用三个不同浓度的dna质粒模板(106、104、102拷贝每微升)，重复进行三次实验评估荧光定量pcr试剂盒的批间差异。结果显示：本发明的荧光定量pcr方法具有较好的重复性。
[0047]
结果见表1：
[0048][0049]
表1.呼吸道腺病毒7型荧光定量pcr检测试剂盒的重复性
[0050]
本发明的荧光定量pcr检测方法具有快速、特异、便捷等优点，具有良好的临床应用前景。
[0051]
应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。