一种脑缺血再灌注损伤生物标志物及脑心通的应用

1.本发明涉及生物医药领域，尤其是一种脑缺血再灌注损伤生物标志物及脑心通的应用。


背景技术：

2.缺血再灌注(ir)是缺血性卒中的一种严重的病理生理变化，脑缺血-再灌注损伤是缺血性卒中(is)治疗过程中的继发性损伤。is占脑卒中病例的70-90％，发病率和死亡率均较高。因此，及时的发现和治疗是is治疗的关键。目前，公认的治疗策略是血管再通，包括溶栓治疗(使用组织型纤溶酶原激活剂等药物)、机械取栓以及这种药物的结合。然而，溶栓和机械取栓的一个关键问题是，它们只能停止缺血，而不能限制再灌注过程中炎症引起的额外损伤。它们也不会诱导任何丢失的神经元的再生。缺血性脑卒中的治疗仍有许多未解的问题，如时间窗口期短、禁忌症等原因。因此，寻找避免或减少脑缺血-再灌注损伤的方法对改善缺血性脑卒中的治疗至关重要。使用有效药物的辅助治疗可能是一种新的治疗方法。
3.脑心通胶囊(nxt)由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、桃仁、红花、乳香(制)、没药(制)、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、全蝎、水蛭组成，临床用于治疗急慢性心脑血管疾病20多年。近年来，进一步的研究证实，nxt通过改善脑功能、减少血清炎症标志物和使外周血血流动力学正常化，对is具有神经保护作用。liu等人通过基于uplc/tof-ms的代谢组学研究表明，nxt可以通过干扰谷氨酰胺代谢和脂质代谢来治疗脑缺血。wang等人利用蛋白质组学技术发现了nxt治疗脑缺血损伤和修复的39个重要候选基因、关键信号通路和核心标记物。然而，nxt的治疗作用及其治疗is的机制尚不清楚。
4.随着新的组学技术的不断出现，多组学数据的综合分析已成为研究者探索疾病发生机制的新方向。整合代谢组学和蛋白质组学分析可以让研究人员了解与疾病相关的代谢和生理变化。此外，多组学联合数据还可应用于个性化医疗、临床评估预测、风险预测和临床结果。本研究希望利用转录组学、蛋白质组学、代谢组学和多组学分析，系统探讨nxt治疗is的分子机制，明确其靶点，为is治疗提供潜在的措施。


技术实现要素：

5.针对以上问题，本技术提供了脑缺血再灌注损伤基因标志物。
6.一种脑缺血再灌注损伤基因标志物，由glb1、gmps、pfas、atic、gaa和acox1组成。
7.进一步的，还包括dgki、gpd1、lipa，atp2b2、ak2。
8.本发明还提供了一种脑缺血再灌注损伤的代谢物标志物。
9.一种脑缺血再灌注损伤的代谢物标志物，由胆固醇、肌苷、次黄嘌呤、5-羟基异戊酸盐、n-乙酰乳糖胺、5,6-环氧二十碳三烯酸、2-花生四烯酸甘油组成。
10.一种脑缺血再灌注损伤的生物标志物，由基因标志物和代谢标志物组成，其中基因标志物由glb1、gmps、pfas、atic、gaa和acox1组成，代谢物标志物由胆固醇、肌苷、次黄嘌
呤、5-羟基异戊酸盐、n-乙酰乳糖胺、5,6-环氧二十碳三烯酸、2-花生四烯酸甘油组成。
11.另外本发明还提供了一种生物标志物和代谢物标志物的应用。
12.脑缺血再灌注损伤基因标志物、脑缺血再灌注损伤的代谢物标志物、或二者组成的生物标志物在制备脑缺血再灌注损伤检测试剂盒中的应用。
13.脑缺血再灌注损伤基因标志物、脑缺血再灌注损伤的代谢物标志物、或二者组成的生物标志物的制剂在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。所述制剂为脑心通胶囊。
14.甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、半乳糖代谢和花生四烯酸代谢作为诊断或治疗cir损伤的潜在药物靶点的应用。
15.本技术我们建立了mcao模型来评估神经功能和评估小腿大小。脑组织代谢组学用于识别不同的代谢物，和代谢谱系统丰富的代谢途径。然后，通过蛋白质组学、转录组学和代谢组学的方法，探索nxt在治疗脑缺血再灌注损伤中的潜在靶点。nxt改善脑缺血再灌注损伤症状。我们发现了参与nxt处理脑缺血再灌注损伤的11个蛋白和相应代谢物。大多数这些代谢物在治疗后被调节以恢复。根据网络药理学研究，我们发现了6个关键基因，包括glb1、gmps、pfas、atic、gaa和acox1，及其相关的核心代谢物和通路。本研究揭示了nxt治疗脑缺血再灌注的复杂机制，为今后的治疗提供了新的策略。
附图说明
16.图1实验过程示意图
17.图2 nxt对mcao大鼠治疗5d后神经系统评分的影响。数值用平均
±
sd(n＝6)表示。***p《为0.001。与模型组相比，
##
p《为0.01。
18.图3 nxt对mcao大鼠脑梗死体积的影响。(a)假手术组、mcao组和nxt治疗组ttc染色冠状脑切片的代表性照片(b)三组脑梗死体积的统计学结果(n＝6)。***p《0.001与假体组，
###
p《0.001与模型组。
19.图4 nxt组中共享靶点的直方图。在假手术组、模型组和nxt组中，反向上调代表“v”型基因表达，而反向下调代表“∧”型基因表达
20.图5信号通路富集分布气泡图。节点大小基于影响值，节点颜色基于-log10(p)值。
21.图6nxt治疗对脑缺血再灌注损伤的ppi网络。节点的颜色反映了其程度。
▲
表示枢纽基因。
22.图7 cluego对潜在目标靶标进行富集分析。
23.图8 cluego的kegg通路富集分析。各通路的p值均为《值0.05。
24.图9 nxt的复合反应-酶基因网络。六边形、菱形、圆形矩形和圆圈分别代表活性化合物、反应、蛋白质和基因。
◆
六边形代表关键代谢物，
▲
代表关键靶点且是枢纽基因，
△
代表代表关键靶点但非枢纽基因。
具体实施方式
25.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中,如无特殊说明,所使用的实验方法均为常规方法。本发明属于国家重点研发计划项目(2019yfc1708600,2019yfc1708604)；国家自然科学基金/重点项目(81630105)；中医药传
承与创新“百千万”人才工程-(岐黄工程)岐黄学者；浙江省中医脑病重点实验室(2020e10012)。
26.1.材料和方法
27.实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，流程如图1所示；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.2.1nxt制备
29.nxt由步长制药有限公司提供，国家药品批准字z20025001，主要含有16种药品，具有祛瘀祛络。
30.2.2脑缺血再灌注(cir)模型准备
31.实验动物为3～4月龄spfsd雄性大鼠，体重280
±
20g，购自上海slyke实验动物股份有限公司，syxk(浙江)2018-0012。所有动物均被饲养在浙江中医药大学动物实验中心的清洁环境中，温度范围为24-26℃，并可自由获得饮用水。7天后进行适应性喂养。该动物实验经浙江中医药大学动物伦理委员会批准(批准文号：iacuc-20180514-04)。
32.所有大鼠均用3％戊巴比妥钠(0.15ml/100g)麻醉，仰卧位固定在手术台上。暴露小鼠的颈部皮肤，用剃须刀和手术剪刀进行消毒，并在颈部中部做一个切口。通过钝性剥离发现右侧颈总动脉(cca)，颈外动脉(eca)和颈内动脉(ica)向上发现。结扎cca近端和eca远端，将ica远端近端分叉打滑结，用动脉夹夹住ica近端分叉。在离cca分叉处10mm处做一个小切口。将4-0手术单丝尼龙缝合线从颈总动脉(cca)插入颈内动脉(ica)，缓慢松开ica上的动脉夹。将距离系绳头部末端20mm的标签推入分叉处，60min后缓慢取出系绳进行再灌注。最后，将切口缝合并消毒。
33.2.3分组
34.sd大鼠随机分为3组，每组13只，即假手术组、大脑中动脉闭塞(mcao)模型组和nxt组。根据人与大鼠之间的体表面积，灌胃给药的等效剂量为0.50g/kg/d。每日1次，每胃胃液量为1.5ml，连续5天。假组和模型组给予相同量的无菌蒸馏水。每组动物在相同条件下喂养，建模后5天进行分析。
35.2.4神经功能评估
36.分别在cir后1、5天对每只大鼠进行神经功能评分。参照longa评分方法，标准为：0：正常，无神经系统缺陷；1：左前爪不能完全伸展。轻度神经功能障碍；2：行走时，老鼠向左旋转(瘫痪侧)。中度神经功能缺损；3：行走时，老鼠倾倒向左侧(瘫痪侧)。严重的神经功能缺损；4：不能自发行走，失去意识；5：死亡。得分越高，神经功能损伤就越严重。每组选择6只成功成型的大鼠进行评分。
37.2.5对梗死面积的评估
38.麻醉后取脑，进入脑槽，-20c冷冻30min，切成2mm厚冠状动脉切片，放入2％ttc溶液中，37℃染色30min后拍照记录。ttc染色后，梗死部分为白色，非梗死部分为红色。根据image j计算出的脑梗死的面积如下。
39.2.6转录组学研究
40.第5天最后一次给药1h后，每组大鼠用异氟烷麻醉，快速取脑，冰上快速分离缺血的半侧脑组织。从脑组织中提取总rna。从脑组织中提取纯化的总rna后，安捷伦2100生物分析仪测定总rna浓度、28s/18s、rin值和片段大小。通过rna浓度和纯度质量控制后，合成双
链cdna，并通过pcr实验富集得到最终的cdna文库。最后，在流槽的每个通道中加入一个cdna文库，采用illuminahiseq测序技术进行测序分析，计算质量评分。对转录酶测序的原始数据进行过滤，获得高质量的数据信息，阈值设置为显著性水平p《0.05和不同折叠长度lold2fchange2，三个样本的mrna不同。基因筛选。以大鼠全基因组为背景和参考，以p《0.05为标准，采用kegg数据库、cytoscapev3.7.1和cluegov2.5.7
41.2.7蛋白质组学研究
42.取料的方法与上述方法相同。称重组织样品，将液氮加入到预冷的液氮砂浆中，然后研磨到粉末中。样品分别用4体积的裂解缓冲液(1％蛋白酶抑制剂、8m尿素和2mmedta)裂解并进行超声处理。12000g低温离心10min，将上清液移至新的离心管中，用bca试剂盒测定蛋白浓度。然后向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇，使最终浓度为5mm，56c时还原30min。加入碘乙酰胺，最终浓度为11mm，在室温下孵育15min，避光。最后稀释样品，使其尿素浓度小于2m。加入胰酶与胰蛋白酶：胰蛋白1：50的质量比例，37℃过夜。然后加入胰蛋白酶与胰蛋白1：100的质量比胰酶消化4h。用高ph反向hplc对肽进行分级，分离组合成分，根据irt试剂说明向组合成分中加入适量的irt试剂，真空冻干进行后续操作和肽溶解与液相色谱流动相a相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)和分离使用easy-nlc1000超高性能液相系统，然后注入nsi离子源电离，然后使用qexactivetmhf-x质谱数据采集。肽母离子及其检测和分析的二级片段。
43.2.8代谢组学研究
44.取料的方法与上述方法相同。称重25mg，放入ep管中；加入800μl预冷二氯甲烷/甲醇(3：1)沉淀剂和2个小钢球；用组织研磨机(功率设置为50hz，5min，时间5min)研磨，将地面样品放入-20c冰箱微球2h，25 000g*4c离心15min，取550μl上清液，将小钢球放入烧杯中；将上清液放入冷冻离心机后，加入600μl脂质化合物溶液(异丙醇：乙腈：水＝2：1：1)，涡旋1min；25 000g*4c离心20min，取550μl上清液，取50μl混合成质量控制样品qc，装入lc-ms注射瓶；所有样品按装样顺序分为96孔板，每孔60μl。随后，分离了uplccshc18柱(100mm*2.1mm，1.7μm，waters，uk)柱，用高分辨率串联质谱xevog2-xsqtof(waters，uk)以正负离子模式收集柱上洗脱的小分子。使用mse模式收集质心数据。
45.2.9蛋白质组、转录组和代谢组的综合分析
46.2.9.1共同靶点和差异代谢物的生物信息学分析
47.当将正常组与模型组进行比较时，nxt组能够上调或下调所有的差异基因，并筛选蛋白质组和转录组来筛选上调或下调的基因。将模型组与nxt组进行比较，对已确定的代谢组数据进行筛选和去冗余。过滤器：1)vip≥1；2)折叠变化≥1.2或≤0.8333；3)q值，三个相交得到一个公共离子。取三个的交点得到普通离子。将差异离子与代谢物数据库hmdb(https://hmdb.ca)中的物质分子进行匹配，结合该数据库kegg中的信息，识别差异代谢物，获得差异代谢物。
48.通过metaboanalyst 5.0数据库的联合途径分析，对确定的共同靶点和差异代谢物进行途径富集分析，获得代谢途径富集图。
49.2.9.2识别关键的代谢物和蛋白质
50.(1)为了可视化代谢物、途径、酶和基因之间的相互作用，将代谢组学中识别的差异代谢物引入配备元景观的细胞景观中，获得化合物-反应-酶基因网络。
51.(2)利用string11.5(https://string-db.org/)中的多个蛋白模块，构建脑缺血-再灌注蛋白-蛋白相互作用(ppi)网络。利用细胞景域的cytohubba插件，通过mcc算法获得top20的枢纽基因。
52.(3)通过cytoscape 3.7.1的cluego插件对确定的共同靶点和差异代谢物进行kegg通路和基因本体论(go)富集分析。其中kegg通路分析设置为pv≤0.05。
53.(4)将复合反应-酶-基因网络与枢纽基因(2)和代谢途径(3)结合，识别关键代谢物和蛋白质。
54.3.结果
55.3.1nxt对大鼠神经功能的影响
56.与假手术组相比，mcao组和nxt组在药物治疗5天后神经功能评分显著升高，差异有统计学意义(p《0.05)。如图2所示。
57.3.2 nxt对脑梗死体积的影响
58.如图3所示，ttc染色显示活组织呈深红色，而右脑半球梗死区域为白色。与假手术组相比，模型组的下体积显著增加(p《0.001)。模型组与nxt组间差异有统计学意义(p《0.001)。
59.3.2结合蛋白质组学和转录组学分析
60.对假手术组和模型组进行了比较和识别。nxt组筛选了两组组中上调或下调的基因。共有342个靶点(共同靶点)，其中上调101个，下调241个。如图4所示。
61.3.3蛋白质组学、转录组学和代谢组学的综合分析
62.3.3.1 cir中共同靶点和差异代谢物的生物信息学分析
63.根据该方法的筛选条件，对模型组与nxt组比较鉴定的代谢组数据进行筛选和去冗余筛选，得到正离子模式下总离子鉴定527个，负离子模式下总离子鉴定390个。将差异离子与代谢物数据库hmdb中的物质分子进行匹配，结合kegg数据库的信息，鉴定出差异代谢物，共鉴定出67种差异代谢物。
64.为了探索nxt在cir大鼠中的代谢途径，我们通过metaboanalyst5.0数据库中的联合通路分析，对已鉴定的共同靶点和差异代谢物进行途径富集分析，最终得到代谢途径富集图。并在路径图上标记路径效应》0.2，p《0.05，如图5所示。
65.根据信号通路富集分析结果，脑缺血-再灌注差异代谢产物的富集信号通路主要为谷胱甘肽代谢、糖胺聚糖降解、嘌呤代谢、鞘脂代谢、酮体合成和降解、烟酸和烟酰胺代谢。与这些途径相关的代谢物是次黄嘌呤、5-羟基异酸、肌苷、鞘氨醇和3-脱氢三甲基胺。
66.3.3.2 cytoscape 3.7.1
67.为了鉴定nxt抗cir的枢纽基因，我们通过cytoscape构建了一个ppi网络。用cytohubba方法计算枢纽基因。通过mcc算法，前20个基因被认为是枢纽基因(glb1、hexb、lap3、mpi、gmps、pfas、hexa、me2、atic、prps2、anpep、gaa、idh2、pgm2、hmgcl、ilk、cd38、renbp、hmgcs1、acox1)。详细信息如图6所示。
68.为了解读潜在靶点的抗cir功能，我们使用cluego进行了go和kegg通路富集分析(图7和8)。氧化石墨烯分析中最重要的术语是嘌呤核糖核苷磷代谢(go：0009167)、作用于糖基键的水解酶活性(go：0016798)、抗生素分解代谢(go：0017001)、nad结合(go：0051287)、对维生素e的反应(go：0033197)。根据kegg富集分析，显著影响的途径是糖胺聚
糖降解、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和过氧化物酶体。
69.为了全面了解nxt对脑缺血再灌注的作用机制，我们构建了一个基于代谢组学和网络药理学的相互作用网络(图9)。将差异代谢物导入cytoscape3.7.2数据库中的metscape插件，收集化合物-反应-酶-基因网络。通过将转录组学和蛋白质组学确定的潜在靶点与metscape分析中的基因进行匹配，我们确定了11个关键靶点，包括glb1、dgki、gpd1、lipa、gmps、pfas、atic、atp2b2、ak2、gaa、acox1(见表1)，其中glb1、gmps、pfas、atic、gaa、acox1是枢纽基因。相关的关键代谢物为胆固醇、肌苷、次黄嘌呤、5-羟基异戊酸盐、n-乙酰乳糖胺、5,6-环氧二十碳三烯酸、2-花生四烯酸甘油。受影响的途径有甘油、磷脂代谢、嘌呤代谢、半乳糖代谢和花生四烯酸代谢。它们可能在nxt治疗cir损伤的作用中发挥重要作用。
70.表1 关键靶点、代谢物和途径的信息
[0071][0072]
glb1、gmps、pfas、atic、gaa、acox1是枢纽基因。
[0073]
3.讨论
[0074]
为了进一步探讨nxt对大鼠脑缺血-再灌注损伤的治疗机制，本研究首先采用三组学方法分别对差异表达基因和差异代谢物进行了分析。其次，对转录组和蛋白质组反向差异表达基因进行了分析和讨论，并分析和讨论了相关的代谢途径。最后，深入地进行了差异代谢物与差异表达基因之间的关联分析。通过数据处理和联合分析，得到关键代谢物和关键靶点，并重点研究相关的代谢途径。在本研究中，我们发现缺血侧脑组织中11种蛋白及其相应代谢物的调控水平受到了影响，而nxt治疗可显著改善这些调控水平。包括glb1、dgki、gpd1、lipa、gmps、pfas、atic、atp2b2、ak2、gaa和acox1(见表1)，其中glb1、gmps、pfas、atic、gaa和acox1为枢纽基因。受影响的途径主要是甘油、磷脂代谢、嘌呤代谢、半乳糖代谢和花生四烯酸代谢。
[0075]
4.结论
[0076]
综上所述，本研究结合多组学方法系统探讨nxt治疗脑缺血再灌注损伤的分子机制。结果表明，nxt对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用与甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、半乳糖代谢和花生四烯酸代谢有关，涉及11个关键靶点，反映了nxt在治疗脑缺血再灌注损伤过程中的多条通路和多个靶点。