新冠病毒全长核衣壳蛋白DNA核酸适体的体外筛选方法

新冠病毒全长核衣壳蛋白dna核酸适体的体外筛选方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及新冠病毒全长核衣壳蛋白dna核酸适体的体外筛选。


背景技术：

2.核酸适体（aptamer）是指通过指数富集的配体系统进化技术（selex）筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与众多靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析、环境监测、基础学、新药合成等方面展示广阔的前景。
3.核酸适体在变复性后可以折叠形成多种多样的二级结构，如茎环结构、发夹结构等与靶标的部分空间结构形成互补，然后在疏水作用、氢键、静电作用及范德华力等分子间作用力下与靶标特异性结合。核酸适体与抗体有很多共性，比如都可以特异性识别并结合某种蛋白，对其靶标都有很好的亲和力和较高的特异性，但核酸适体在很多方面比抗体更有优势，主要体现为以下几点：（1）核酸适体更容易合成与化学修饰，可以通过固相合成法人工化学合成，批间差异小，合成的成本低，合成时可以修饰某些化学基团，增强其稳定性并可以方便后续偶联药物等。相比之下，抗体的合成需要准备抗原、选择免疫动物、细胞融合并扩大培养等等，后续还需要一系列的纯化步骤，整个流程是非常复杂而且费时的，而且不同批次合成的抗体之间会有些差异。
4.（2）核酸适体的稳定性更好，保存只需放在-20 ℃冰箱即可，而且保存时间长。而抗体的保存条件就比较严苛，且放几个月后抗体活性就会降低，影响其使用。
5.（3）核酸适体的免疫原性比抗体低。
6.（4）核酸适体的靶标范围更加广泛，各种小分子、金属离子、多肽或者蛋白、核酸以及细胞等等都可以作为筛选的靶标，而抗体的靶标大多为蛋白质。
7.体外指数富集的配体系统进化（selex）技术，其基本原理是利用寡核苷酸文库与靶分子间的相互作用，从事先构建好的随机单链寡核苷酸文库中筛选并分离出可特异结合靶分子的核酸序列，再利用聚合酶链式反应（pcr）体外扩增技术，使文库中具有特异性的序列得到指数富集。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种高效的筛选核酸适体的方法以及根据此方法筛选的核酸适体，该方法筛选得到的核酸适体亲和力强。
9.为达到上述发明目的，采用如下技术方案。
10.一种用于筛选核酸适体的组合物，包括固相支持物以及与固相支持物结合的目标分子或目标分子的一部分，目标分子为新型冠状病毒核衣壳蛋白和/或dna；固相支持物包括磁珠和/或琼脂糖凝胶珠。磁珠和琼脂糖凝胶珠都能够直接、高效、快速地连接目标分子。
11.优选地，磁珠包含羧基修饰和/或组蛋白修饰；琼脂糖凝胶珠包含链霉亲和素修饰。
12.更优选地，制备上述组合物的方法包括如下步骤：取羧基磁珠，活化表面羧基后，加入新型冠状病毒核衣壳蛋白进行孵育；孵育后封闭磁珠表面未反应的位点，洗涤即得组合物。
13.更优选地，制备上述组合物的方法包括如下步骤：取琼脂糖凝胶珠，加入新型冠状病毒核衣壳蛋白进行孵育，孵育后洗涤即得组合物。
14.更进一步优选地，使用n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）进行羧基的活化。
15.本发明还公开了一种用于筛选核酸适体的反应体系，反应体系包括：单链dna文库，该单链dna文库包括至少一条能够特异性识别所述目标分子或目标分子的一部分的核苷酸链；引物，该引物用于扩增核酸适体文库，序列如seq id no.6和seq id no.7所示：seq id no.6：cttctgcacgcctccttcc；seq id no.7：agtgtccgccgatctcgtctcc；上述用于筛选核酸适体的组合物；缓冲液。
16.优选地，所述缓冲液包括dpbs缓冲液。
17.优选地，单链dna文库如seq id no.8所示：seq id no.8：cttctgcacgcctccttcc（n35）ggagacgagatcggcggacact。
18.本发明还公开了一种筛选核酸适体的方法，包括如下步骤：合成引物和单链dna文库；磁珠法筛选；其中包括配制权利要求3或4中所述的反应体系、正筛和反筛、pcr扩增。
19.优选地，配制用于筛选核酸适体的反应体系，包括如下步骤：合成单链dna文库以及引物；制备用于筛选核酸适体的组合物。
20.优选地，正筛包括使用与新型冠状病毒核衣壳蛋白磁珠进行正筛；反筛包括使用his 磁珠进行反筛。
21.优选地，磁珠法筛选的筛选轮数至少为9轮。
22.优选地，上述方法筛选出的核酸适体的亲和力kd可达5 nm以下。
23.本发明筛选出的核酸适体具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记。
24.本发明还公开了一种复合物，其特征在于，包括：用于筛选核酸适体的组合物，和上述方法筛选出的核酸适体。
25.优选地，核酸适体包括：n2-62：
no.2）；n35：cacgtcgggggggtcacacatgaaccgtgcggatacggagacgag（seq id no.3）；n1-53：ccgccacgatcggattcgtctcggctctatcggattggagacgagatcggcgg（seq id no.4）;n2-56:cgcctacgggatcggattccccactcggctctatcggattggagacgagatcggcg（seq id no.5）。
30.优选地，本发明还公开了一种用于检测环境中新型冠状病毒的方法，包括：对环境中待测区域进行取样；将样品与上述用于检测环境中新型冠状病毒的试剂混合孵育；混合孵育后测定混合物中的荧光强度，进行结果判定。
31.本发明还公开了一种检测环境中sars-cov和/或sars-cov-2的方法，包括：对环境中待测区域进行取样；将样品与上述方法筛选出的核酸适体进行混合得到混合物；检测混合物中是否含有sars-cov-核酸适体复合物或sars-cov-核酸适体复合物。
32.优选地，核酸适体包括：n2-62：cgcctccttccacgggatcggattccccactcggctctatcggattggagacgagatcggcg（seq id no.1）；n10：cgcctccttcctctcggggtgtgtagggtcagggagtgtgagaggaggagacgagatcggcg（seq id no.2）；n35：cacgtcgggggggtcacacatgaaccgtgcggatacggagacgag（seq id no.3）；n1-53：ccgccacgatcggattcgtctcggctctatcggattggagacgagatcggcgg（seq id no.4）;n2-56:cgcctacgggatcggattccccactcggctctatcggattggagacgagatcggcg（seq id no.5）。
33.优选地，检测环境中sars-cov和/或sars-cov-2的方法，还包括使用试纸检测混合物中是否含有sars-cov-核酸适体复合物和/或sars-cov-2-核酸适体复合物。
34.更优选地，试纸包括：硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸；其中，硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线，检测线所使用的抗体包括sars-cov抗体，质控线所使用的抗体包括抗链霉亲和素抗体；结合垫上含有上述方法筛选出的核酸适体。
35.本发明还公开了核酸适体n2-62、n10、n35、n1-53、n2-56在检测环境中新型冠状病
毒和/或sars-cov中的用途。
36.本发明还公开了上述方法筛选出的核酸适体的用途，包括以下至少一种：特异性识别sars-cov-2；特异性结合sars-cov-2；制备用于检测或鉴别sars-cov-2的试剂；负载治疗新型冠状病毒肺炎的药物；靶向递送治疗新型冠状病毒肺炎的药物；结合新型冠状病毒的显影剂或示踪剂。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明使用selex技术，筛选出了能够特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适体，并且亲和力高，亲和力kd可达5 nm以下。此外，本发明所设计的单链dna文库能够提高筛选效率，仅需要9轮筛选即可获得高亲和力的核酸适体。本发明核酸适体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短等特点，能够用于生化分析、环境监测、基础学、新药合成等方面。
附图说明
38.图1为富集文库与靶标蛋白和对照蛋白结合情况；图2为核酸适体n2-62亲和力检测数据；图3为核酸适体n10亲和力检测数据；图4为核酸适体n35亲和力检测数据；图5为核酸适体亲n1-53和力检测数据；图6为核酸适体亲n2-56和力检测数据。
具体实施方式
39.这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与本公开的一些方面相一致的方法的例子。
40.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.实施例1核酸适体的筛选一、合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物：随机单链dna文库：seq id no.8：5
’‑
cttctgcacgcctccttcc（n35）ggagacgagatcggcggacact-3’；其中，“n35”表示35个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
42.引物信息如seqid no.6和seq id no.7所示，由金唯智生物科技有限公司合成。
43.seq id no.6：cttctgcacgcctccttcc；
seq id no.7：agtgtccgccgatctcgtctcc；引物分别用ddh2o溶解配制成50 μm的贮存液，于-40℃保存备用。
44.二、磁珠法筛选采用磁珠法筛选，共计筛选9轮，具体筛选方法如下：1、羧基磁珠固定新型冠状病毒核衣壳蛋白取200 μl羧基磁珠，用200 μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。分别取100 μl配置好的 nhs（n-羟基琥珀酰亚胺；0.1m水溶液）和edc（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4m水溶液），等体积混合，加入到磁珠中，室温孵育20min活化磁珠表面的羧基，然后用dpbs缓冲液清洗1遍后备用；取80μl的新型冠状病毒核衣壳蛋白（购自义翘神州，40588-v08b，浓度为0.5mg/ml），加入ph4.5的10mm，260 μlnaac-hac缓冲溶液混匀，加入到上述的活化磁珠中；置于垂直混合仪上室温孵育2h，新型冠状病毒核衣壳蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面；偶联结束，将偶联管置于磁力架上，吸弃上清，用dpbs缓冲液清洗1遍，取200μl，1m乙醇胺ph8.5加入到磁珠中，在垂直混合仪上室温孵育15min，封闭磁珠表面未反应的活化位点。然后置于磁力架上，吸弃封闭液，用200 μl dpbs缓冲液清洗3遍，最后溶解在200 μl dpbs缓冲液中。
45.2、反筛与筛选反筛磁珠制备：将his小肽与磁珠偶联，his小肽由杭州丹港生物科技有限公司合成，为9个连续的组氨酸，偶联his小肽的步骤与偶联新型冠状病毒核衣壳蛋白相同。his小肽的浓度为20mg/ml，用 ph4.5的10mm naac-hac缓冲溶液稀释，具体的，取4 μl his小肽，加入396 μl，ph 4.5的10mm naac-hac缓冲溶液混匀，加入500 μl乙醇胺封闭，最后溶解在500 μl dpbs中，其余步骤一样。
46.文库溶解与变复性处理：取1od随机单链核苷酸文库，13000 rpm离心2min，加入pbs缓冲液溶解，放到95 ℃金属浴中变性10 min，然后放到冰上冷却5 min，室温放置15 min使其形成稳定构象。
47.文库与磁珠孵育：取一定量his磁珠，用pbs缓冲液洗涤，将处理后的文库加入到his磁珠中，同时加入一定量的鲱鱼精dna、bsa以及氯化钠溶液混匀后在垂直混合仪上室温孵育一段时间；置于磁力架上，收集上清，与新型冠状病毒核衣壳蛋白磁珠进行正筛；第一轮只有正筛，从第二轮开始，在进行以新型冠状病毒核衣壳蛋白为靶标的正筛之前都先用his磁珠进行反筛，反筛上清作为单链核苷酸文库加入2 μl，20 mg/ml的his蛋白与新型冠状病毒核衣壳蛋白磁珠进行正筛；正筛反筛后的磁珠加100 μl ddh2o，95 ℃金属浴10 min，置于冰上冷却一段时间，然后磁吸取上清作为elution；为了进一步增大筛选压力，从第五轮开始加入了病毒裂解液以及人血清。
48.qpcr监测反应进程：以elution中的核酸分子为模板，用qpcr进行扩增；方法如下：分别取2 μl正筛与反筛elution加入18 μl qpcr mix中混匀，qpcr扩增30个循环，分析数据。
49.3、pcr大量扩增
根据qpcr数据确定扩增循环数，将剩余的正筛elution加入pcr mix中扩增相应的循环数。
50.4、制备单链由于pcr扩增后得到的双链dna有其中一条链修饰了生物素，本实验用带有链霉亲和素标记的琼脂糖凝胶珠通过链霉亲和素和生物素的作用捕获双链dna，然后通过naoh的变性作用将目标单链dna解离下来，具体的实验步骤如下：1）与琼脂糖凝胶珠孵育：将带有滤芯的200 μl的枪头放到1.5 ml的ep管中，加入60 μl链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠，用dpbs洗涤两次，每次100 μl，洗涤后把pcr3扩增所得到的双链dna产物加入装有琼脂糖凝胶珠的枪头中，每次100 μl，用200 μl 的枪将液体打到废液杯中，产物加完后再用dpbs洗涤两遍。
51.2）加入100 μl 40 mm的氢氧化钠溶液，并收集到一个新的ep管中，加入4μl 1m的hcl溶液中和，再加入104 μl 2
×
dpbs溶液，即得到用于下一轮筛选的文库。
52.3）浓度测定：通过nanodrop测量a260值乘以od值得到ssdna浓度，乘以体积得到最终的产量。
53.三、重复筛选磁珠法重复筛选9轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，文库进行变复性处理之后，添加相应体积的鲱鱼精dna以及bsa，调整氯化钠的浓度，然后与偶联好蛋白的磁珠进行孵育；筛选后用spr检测dna单链文库对sars-cov-2核衣壳蛋白识别能力的变化，当dna单链文库对sars-cov-2核衣壳蛋白的识别能力满足要求，即筛选后的dna单链文库与靶标蛋白的结合能力高于筛选起始投入的文库（图1），图中pool1，pool3，pool5，pool7，pool9分别表示第1轮、第3轮、第5轮、第7轮和第9轮筛选得到的文库，可以看出第9轮得到的文库比第一轮与靶标的亲和力高很多，满足测序要求，将所得文库经高通量测序分析。
54.四、分析和鉴定将得到的富集文库产物经高通量测序分析后，挑选若干条序列由通用生物合成，检测亲和力；在后续检测中，确定了4-6条序列具有很强的结合能力，将3条序列进行截短之后分别得到了seq id no:1-5所示的核酸适体分别命名为n2-62、n10、n35、n1-53、n2-56。亲和力表征如图2-6所示。
55.实施例2检测sars-cov试纸的制备1、核酸适体偶联乳胶颗粒将链霉亲和素（sa）修饰的乳胶颗粒（质量分数1%，杭州优思达提供）用超纯水稀释一倍至质量分数为0.5%；然后，向质量分数为0.5%的sa修饰的乳胶颗粒加入4倍过量生物素修饰的核酸适体进行交联，交联条件为室温震荡1 h；将所得到的交联产物通过离心法除去上清液中未结合到乳胶颗粒表面的核酸适体序列，离心条件为4℃，10000 rpm，10 min；然后通过离心法用超纯水洗涤交联产物两次，最终用50 μl的点胶液定容待后备用；按照上述操作方法，制备乳胶颗粒-核酸适体偶联物，当使用多条核酸适体与乳胶
颗粒制备乳胶颗粒-核酸适体偶联物时，有如下标记方法：1）混合标记，即不同的核酸适体序列标记至同一个乳胶颗粒标表面；2）单一标记，即同一种核酸适体序列标记至同一个乳胶颗粒标表面，然后将不同的乳胶微球进行混合使用；根据不同的标记方法以及不同的核酸适体，制备出不同的乳胶颗粒-核酸适体偶联物，偶联物如表1所示。
56.2、预处理按配方配制如下处理液：样品垫处理液：1 m tris-hcl缓冲液，1% pvp，1% peg，5% bsa，ph为9.0；结合垫处理液：0.2 m tris-hcl缓冲液，5% bsa，1% pvp，2% peg，20% 蔗糖，ph为8.0；透析液：0.008 mol/l nacl，ph 7.0；配制完成后进行预处理：样品垫处理：将玻璃纤维浸润在样品垫处理液中，静置30 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；结合垫处理：将玻璃纤维浸润在结合垫处理液中，静置30 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；抗体透析：将抗体稀释后装入透析袋中依次放入透析液和三蒸水中透析12 h；3、喷涂乳胶颗粒将乳胶颗粒-核酸适体偶联物通过划膜机喷涂于预处理后的结合垫上，乳胶颗粒-核酸适体偶联物质量分数为0.5%，喷量为6 μl/cm；4、划膜使用划膜机进行划膜，检测线（t线）使用的抗体为：sars-cov核衣壳蛋白抗体，浓度为2 mg/ml；质控线（c线）使用的抗体为：抗链霉亲和素抗体，浓度为1 mg /ml；5、组合依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装到pvc板上即得试纸条。
57.表1 乳胶颗粒-核酸适体偶联物以及试纸试纸序号（同偶联物序号）核酸适体组合标记方法1n35单一标记2n10单一标记3n2-62单一标记4n35/n2-62单一标记5n35/n10单一标记6n2-62/n10单一标记7n35/n2-62/n10单一标记8n35/n2-62混合标记9n35/n10混合标记10n2-62/n10混合标记
11n35/n2-62/n10混合标记试验例1核酸适体亲和力检测使用表面等离子共振（spr）检测sars-cov-2核衣壳蛋白核酸适体与sars-cov-2核衣壳蛋白的亲和力和特异性检测。
58.1、将通用生物合成的核酸适体n2-62、n10、n35，分别用dpbs缓冲液稀释成200 nm。
59.2、将sars-cov-2核衣壳蛋白偶联到cm5芯片表面的第2通道：然后用将等体积的edc（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4 m水溶液）和nhs（n-羟基琥珀酰亚胺；0.1 m水溶液）两个试剂混合后进样50 μl活化芯片，流速5 μl/min；将sars-cov-2核衣壳蛋白用ph 4.5的10mm醋酸钠稀释至终浓度为50 μg/ml后进样，进样体积50μl，流速5 μl/min，sars-cov-2核衣壳蛋白偶联量为2000 ru；进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5 μl/min，进样50 μl；第1通道按照上述处理，只是不进行偶联蛋白的步骤，活化和封闭的步骤完全一样，作为对照通道。
60.3、检测：使用表面等离子共振仪（ge healthcare，型号：biacore t200）设定动力学检测参数，步骤1中稀释好的4种适配体样品依次流过1、2、3、4通道，每一个适配体的程序如下：进样30 μl/min
×
2 min，解离 30 μl/min
×
3 min，再生1 m nacl 30 μl/min
×
0.5 min，将稀释好的核酸适体依次进样。
61.亲和力检测数据见图2-6，每一条曲线是通道2差减通道1之后的曲线，说明了对应的核酸适体与靶标蛋白n蛋白的结合能力。这些数据说明核酸适体n2-62、n10、n35用 spr 仪均检测到与sars-cov-2核衣壳蛋白有很强的结合，kd值分别如下表1所示。
62.表1 sars-cov-2核衣壳蛋白与核酸适体的亲和力名称亲和力kd（nm）seqidno:1（n2-62）3.24seqidno:2（n10）5.91seqidno:3（n35）2.41seqidno:4（n1-53）4.01seqidno:5（n2-56）5.96由表1可知，本发明筛选出的核酸适体与新型冠状病毒核衣壳蛋白亲和力良好，可达5 nm以下，甚至低于3 nm，说明本发明核酸适体能够准确、高效地识别和结合新型冠状病毒。
63.试验例2sars-cov的检测通过滴加不同浓度的含sars-cov的缓冲液，观察试纸条出现条带的情况：将上述sars-cov使用dpbs缓冲液配制成浓度为100 pg/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml的标准液，用胶头滴管吸取标准液，滴3滴在样品垫上，滴加后静置15 min后进行结果判读：阳性(+)：出现两条带，检测线和质控线，表示样本中存在sars-cov或sars-cov；阴性(-)：仅质控线出现一条带，检测线无条带出现，表示样本中没有sars-cov或sars-cov；
无效：质控线未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效，应重新测试。
64.检测结果如表3所示。由表3可见检测效果良好，说明本发明筛选的核酸适体能够有效检测出环境中的sars-cov。
试纸序号sars-cov（100ng/ml）sars-cov（10ng/ml）sars-cov（1ng/ml）sars-cov（100pg/ml）sars-cov（0）1+++
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4+++
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7+++
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8+++
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9+++
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10+++
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11+++
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65.本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
66.以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。