西瓜果实大小基因snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及西瓜分子标记辅助育种领域技术领域，具体涉及一种西瓜果实大小基因snp分子标记及其应用。
背景技术：
2.西瓜（citrullus lanatus）属葫芦科西瓜属，是世界十大水果之一。我国是世界第一大西瓜生产国和消费国，西瓜的栽培面积和产量均居世界首位。西瓜果实大小是极为重要的性状，然而人们对西瓜栽培品种果实大小变异的遗传学基础知之甚少；因此，研究探索西瓜果实大小的遗传性状可以为西瓜分子育种和遗传改良提供新的方向。
3.目前，随着三代测序技术的快速发展、成本降低、以及相关生物信息技术的发展，无论模式物种还是非模式物种都能鉴定出大量分子标记位点。分子标记如indel、snp可广泛应用于园艺作物遗传图谱的构建、qtl分析、分子标记辅助选择育种等。因此，当前亟待开发一种与西瓜果实大小紧密连锁的、易于操作的、鉴定效率高的、成本较低的分子标记，以期可为西瓜果实大小基因精细定位和分子鉴定研究提供高效的技术手段。
4.公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
5.鉴于以上技术问题中的至少一项，本公开提供了一种西瓜果实大小基因的snp位点（基于西瓜97103参考基因组序列v2版，西瓜基因组8号染色体第27105097bp处碱基由t突变为c），基于snp位点的酶切信息设计了caps分子标记引物v2ft36。
6.根据本公开的一个方面，提供一种西瓜果实大小基因snp分子标记，基于西瓜97103参考基因组v2版，位于8号染色体27105097bp处的碱基由中等果实性状的t突变为小果实性状的c。
7.根据本公开的另一个方面，提供一种检测试剂盒，包括maeii限制性内切酶及如下引物v2ft36：正向引物v2ft36f：5
’‑ꢀ
aacacgaatgggcatcaata
ꢀ‑3’
；反向引物v2ft36r：5
’‑ꢀ
caccaaacgccaaactctta
ꢀ‑3’
。
8.根据本公开的另一个方面，将所述snp分子标记或所述检测试剂盒应用于西瓜果实大小品种/系选育中。
9.根据本公开的另一个方面，提供一种鉴定西瓜果实大小基因型的方法，包括如下步骤：（1）提取待鉴定西瓜总dna后以权利要求2中所述引物v2ft36进行pcr扩增：（2）以maeii限制性内切酶酶切上步所得pcr产物；（3）对所得酶切产物进行电泳图谱分析，基于所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，其中，出现142bp和211bp两条带则代表小果实基因型，出现353bp的条带代表中等果实基因型。
10.在本公开的一些实施例中，在所述步骤（1）中，利用植物基因组dna提取试剂盒tiangen提取待鉴定西瓜叶片总dna。
11.在本公开的一些实施例中，在所述步骤（1）中， pcr扩增体系为：西瓜叶片总dna 1μl、所述正向引物v2ft36f 1μl、所述反向引物v2ft36r 1μl、2
×ꢀ
power taq pcr mastermix 12.5μl、ddh2o 9.5μl；扩增程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 30s、52℃1 min、72℃30 s，72℃ 10min。
12.在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，酶切反应体系为：pcr产物5μl，maeii限制性内切酶0.5μl，10
×
buffer 1.5μl，ddh2o 8μl；反应程序为：37℃恒温处理10小时，65℃灭活10分钟。
13.本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：1. 设计了一个西瓜果实大小基因共分离的分子标记，应用该标记进行分子标记辅助选择育种，能以更快速、准确的进行西瓜果实大小的定向遗传改良。
14.2. 在不同果实大小的西瓜群体中进行了应用，其基因型准确率为100%，可为鉴定西瓜果实大小提供新手段，提高育种的准确性和选择效率。
15.3. 通过简便的实验操作和分析即可快速鉴定西瓜果实大小，为西瓜果实大小性状的检测提供了快速、简便、科学实用的检测鉴定技术。
附图说明
16.图1为本技术一实施例中的西瓜果实大小性状qtl定位结果。
17.图2为本技术一实施例中的西瓜8号染色体分子标记v2ft36的引物在西瓜b166（父本）、s16（母本）、s17（f1）及部分随机s18群体中的pcr酶切结果图；其中，a：父本基因型，b：母本基因型，h：f1杂合基因型，m：marker。
具体实施方式
18.为了更好的理解本技术技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
19.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
20.实施例一：西瓜果实大小基因的确定及分子标记的开发对不同类型的西瓜材料进行简化基因组测序，结合群体多态性的差异确定群体间的受选择区域，获得与西瓜果实大小类型相关的染色体区间，利用小果实西瓜材料和中等果实西瓜材料的深度重测序筛选目标染色体区间内的snp位点，并设计caps/dcaps分子标记引物，再利用caps/dcaps分子标记引物及西瓜基因组dna进行pcr扩增，最后对扩增产物酶切后利用电泳进行验证。所述各个供试材料均为中国农业科学院郑州果树研究所中国西瓜甜瓜中期库保存的创新种质材料。
21.具体步骤如下：（1）西瓜果实大小性状主效qtl区间初步定位利用西瓜极大果实母本b38（中国农业科学院郑州果树研究所中国西瓜甜瓜中期库编号zxg03282）和小果实父本b166（中国农业科学院郑州果树研究所中国西瓜甜瓜中期
库编号zxg02728）杂交获得f1，后f1与b166回交获得bc1群体构建的高密度的遗传连锁图谱，对父母本、f1和bc1群体的83个单瓜进行果实大小的直观鉴定；结合遗传连锁图谱和bc1群体表型鉴定结果，利用r/qtl-cim方法进行qtl初定位，鉴定到果实大小的主效qtl。该qtl位于8号染色体上（参见图1），其lod峰值为8.03，解释41.37%的表型变异，置信区间为25760764bp-28051220bp。
22.（2）西瓜果实大小性状主效qtl区间精细定位a. 选取小果实西瓜b166为父本、中等果实西瓜s16（中国农业科学院郑州果树研究所中国西瓜甜瓜中期库编号zxg00453）为母本、两者杂交后的中等果实西瓜s17为f1以及s17与父本的回交群体s18，利用植物基因组dna提取试剂盒（tiangen）提取西瓜叶片总dna，具体步骤如下：
①
取植物新鲜组织100 mg或干重组织20 mg，加入液氮充分碾磨。加入400 μl缓冲液fga和6μl rnase a（10 mg/ml），旋涡振荡1 min，室温放置10 min。
23.②
加入130μl缓冲液lp2，充分混匀，旋涡振荡1 min。
24.③
12,000 rpm（～13,400
×
g）离心5 min，将上清移至新的离心管中。
25.④
加入1.5倍体积的缓冲液lp3(例如500μl的滤液加750μl缓冲液lp3) (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀。
26.⑤
将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm（～13,400
×
g）离心30sec，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中。
27.⑥
向吸附柱cb3中加入600μl 漂洗液pw (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400
×
g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
28.⑦
重复操作步骤
⑥
。
29.⑧
将吸附柱cb3放回收集管中，12,000 rpm (～13,400
×
g) 离心2 min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
30.⑨
将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200 μl洗脱缓冲液tb，室温放置2～5 min，12,000 rpm（～13,400
×
g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。
31.⑩
用紫外分光光度计测定dna的浓度，并于-20℃冰箱中保存备用。
32.b. 鉴定西瓜果实大小性状的caps标记引物的设计利用父本和母本西瓜材料的深度重测序筛选目标染色体区间存在的snp突变位点，该位点位于西瓜基因组（西瓜97103参考基因组序列v2版）8号染色体27105097bp处，其碱基由t突变为c，（t、c分别代表中等果实基因型和小果实基因型）。
33.分析snp位点的酶切信息，获得存在caps/dcaps突变的序列，将该西瓜果实大小类型的特异caps分子标记命名为v2ft36，设计caps分子标记引物：正向引物核苷酸序列为v2ft36f：aacacgaatgggcatcaata；反向引物核苷酸序列为v2ft36r：caccaaacgccaaactctta；采用的限制性内切酶为maeii。
34.c. pcr反应体系和程序反应体系：100 ng/μl西瓜植株总dna 1μl、caps分子标记上游引物v2ft36f 1 μl、下游引物v2ft36r 1 μl、2
×
power taq pcr mastermix 12.5 μl、ddh2o 9.5 μl；
反应程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 30s、55℃ 1 min、72℃ 30 s，72℃ 10min；d. 酶切反应体系和程序：反应体系为：pcr产物5μl，maeii限制性内切酶0.5μl，10
×ꢀ
buffer 1.5μl，ddh2o 8μl；反应程序为：37℃恒温处理10小时，65℃灭活10分钟；e. 对酶切产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。
35.试剂配制：
①5×
tbe电泳缓冲液：称取tris 26.95g，edta 1.86g，硼酸13.75g，去离子水定容至500ml；
②
40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺77.34g，甲叉双丙烯酰胺2.66g，去离子水定容至200ml；
③
8％聚丙烯酰胺凝胶：40％聚丙烯酰胺溶液10ml；5
×
tbe 5ml；10％过硫酸铵(aps)200μl；四甲基乙二胺(temed)80μl；蒸馏水22ml；
④
银染液：硝酸银1g；冰醋酸5ml；无水乙醇50ml；加去离子水定容至500ml；
⑤
显影液：氢氧化钠15g；甲醛(37％)2.5ml；加去离子水定容至500ml。
36.f. 凝胶板准备凝胶玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子，凹形玻璃向内侧。在洗瓶内配制8％聚丙烯酰胺凝胶溶液，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，并注意防止有气泡产生，注满后迅速插入有齿的梳子，梳子底部与胶面刚好接触为宜，等待溶液充分凝固。
37.g. 电泳将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1
×ꢀ
tbe缓冲液。在pcr产物中加入0.2倍体积的6
×ꢀ
dna loading buffer，混匀后取0.8μl加入点样孔内，260v电泳35min。
38.h. 染色和显影：电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15min，凝胶会自动脱落下来；银染完毕后，将凝胶取出放入去离子水中清洗10s；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上观察并拍照保存。
39.i. 带型判读将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，观察父母本以及s18群体条带的位置差异。
40.利用v2ft36分子标记在s18群体中的基因型鉴定的结果如图2所示，酶切后父本目的片段大小为142bp和211bp两条带，母本目的片段大小为353bp。酶切产物条带为142bp和211bp两条带为小果实西瓜类型，酶切产物条带为353bp的为中等果实西瓜类型，产物条带为142bp、211bp和353bp三条带的为中等果实西瓜类型。
41.实施例二：s18群体基因型分析经实施例一进行v2ft36分子标记在由父本b166和母本s16构建bc1群体中的基因型鉴定后，检查v2ft36分子标记的两种基因型在96个bc1群体中的分布情况，发现v2ft36基因型与西瓜果实大小表型完全共分离。结果如表1所示，其中a代表父本带型，b代表母本带
型，h代表杂合基因型。
42.分子标记v2ft36的基因型为a的55个株系全部是小果实西瓜类型（小西瓜），而在基因型为b的41个株系都是中等果实西瓜类型（中等），其基因型鉴定的准确率为100%。
43.尽管已描述了本发明的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
44.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本技术权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
45.表1 v2ft36在s18群体中的鉴定和验证。