一种猫传染性腹膜炎病毒的纯化方法

本发明属于病毒学领域，具体涉及一种猫传染性腹膜炎病毒的纯化方法。

背景技术：

1、冠状病毒(coronavirus，cov)属套式病毒目，为单股正链核糖核酸(rna)囊膜病毒，其基因组长度可达26.4～31.7kb，是最长的rna病毒之一。基因组5’、3’端分别包含甲基化帽子结构及多腺苷酸化尾巴结构，通过rna依赖性rna聚合酶(rdrp)识别下游转录调控序列(body-trs)及前导转录调控序列(leader-trs)直接调控从正义基因组rna到负义亚基因组rna的合成，后负义rna亚基因组转录为对应的、具有相同5’端及部分重复3’端的正义信使rna(mrna)，呈现套式转录特征。冠状病毒包括α-、β-、γ-以及δ-covs四种亚型，能够引起哺乳动物和禽类的呼吸道感染。β-covs突变体可以导致人类致死性疾病。

2、α-cov是除β-cov以外，目前发现存在致病性人源cov的亚型，包括hcov-229e及hcov-nl63，通常只引起普通感冒及上呼吸道感染。猫冠状病毒(fcov)属于α-cov，包括猫传染性腹膜炎病毒(fipv)，感染后会发展为对猫致死的传染性腹膜炎(fip)，死亡率接近100％。fipv可以根据其病毒s蛋白氨基酸序列以及抗体中和情况分为血清型i(fipv i) 和血清型ii(fipv ii)两类。其中i型fipv被证明完全由猫源fcov衍生而来，而ii型fipv 则来源于fcov与犬cov(ccov)之间的重组。在分子水平缺乏对于cov与宿主相互作用机制的认识，例如cov如何识别受体并入侵细胞，如何实现免疫逃逸以及宿主免疫系统如何抵抗cov感染，cov所引起的人兽共患病持续性风险对于人类健康和全球经济发展带来了巨大威胁。

3、冷冻电镜技术(cryo-electron microscopy)的迅速发展，特别是单颗粒分析技术(single particle analysis，spa技术)的出现，已可以将各个角度分布的单颗粒分子进行对齐并三维重构，非常适合高对称性生物大分子的结构生物学研究，如具有二十面体对称性排列的病毒核衣壳蛋白。随着直接探测电子(ddd)相机以及子断层图像平均算法(sub-tomogram average，sta)的出现，冷冻电子显微镜断层成像技术(cryo-electrontomography，cryo-et)已经被广泛应用于生物大分子的原位成像。通过将样品在±70°范围内逐渐倾斜，连续拍摄获得样品在 x-、y-、z-三个方向的不同视野，并进行后续的图像处理以三维重构出高分辨率结构。考虑 cryo-et对于样品厚度的耐受范围，非常适合利用其研究cov等非对称病毒颗粒的原位结构。目前使用cryo-et技术已能够获得中等分辨率原位结构信息。随着技术的改进还可以进一步提升，可以在原位观察到抗体结合抗原表位情况，在抗体药物研发方面发挥着越来越重要的作用。冷冻电镜技术一般对于病毒颗粒样品的浓度、纯度要求较高，而病毒颗粒的纯化多采用超速离心的方法。

4、超速离心机是一种针对高速旋转转子进行优化的离心机，能够产生高达1,000,000xg(约 9,800km/s2)的加速度，在分子生物学、生物化学和聚合物科学中。基于超速离心的密度梯度离心技术发展成熟，已可对几乎任何种类的完整生物类颗粒进行分离或分析，并达到较高纯度。特别地，病毒颗粒的纯化，往往采用密度梯度离心作为首选方法，其根据病毒颗粒与对应培养介质中的其他颗粒的尺寸与密度差异进行分离，较大的颗粒比较小的颗粒沉降得更远，在长时间快速离心过程中，颗粒移动到梯度中介质密度与颗粒密度相同的位置，以获得较好的纯化效果。

5、猫传染性腹膜炎病毒(fipv)，作为ɑ-冠状病毒(α-cov)研究的较好模型，具有操作安全、易于培养等优点。由于针对其展开的结构生物学工作较少，并没有针对fipv完整病毒颗粒完善的纯化方法。一方面由于冷冻电镜技术对于病毒颗粒样品浓度的较高要求；另一方面对于fipv，其大部分毒株因复制能力差，或因毒力过强导致病毒并未复制达到顶峰就引起细胞死亡，很难获得足够的病毒拷贝，所以往往需要收集大量fipv病毒样品培养物用于数据收集。对于较大量fipv样品纯化，密度梯度离心方法最大的难点之一，在于执行梯度离心之前需要对样品进行富集与浓缩。目前较为常用的样品富集方式包括切向流及中空纤维柱超滤以及聚乙二醇-8000(peg-8000)沉淀浓缩法以及超速离心富集等。切向流及中空纤维柱超滤的方法存在浓缩后样品损耗较大的缺点。相对的peg-8000沉淀浓缩的方法被认为是应用于cov病毒颗粒冷冻电镜及蛋白质组学分析的高效纯化方法，具体为在通过离心的方法去除病毒培养液中的细胞碎片后，将包含病毒颗粒的细胞上清加入peg-8000(终浓度10％) 及nacl(终浓度2.2％)中，进行蛋白沉淀，其中包含目的病毒颗粒。为了降低病毒病毒颗粒的损耗，peg沉淀下来蛋白混合物需要快速进行高速离心(10,000xg)。申请人前期工作中发现，这样的高速离心会导致病毒颗粒在沉淀中难以被重悬，需要采用涡旋或者移液枪反复用力吹打的方法，纯化样品后通过负染电镜分析发现peg-8000沉淀浓缩的方法会造成 fipv囊膜发生破裂，严重影响后续的结构生物学相关研究。因此开发一种适合较为脆弱冠状毒株的病毒纯化方案是十分必要的。

技术实现思路

1、为解决fipv病毒颗粒较为脆弱、不易纯化的问题，本发明旨在提供一种猫传染性腹膜炎病毒的纯化方法。

2、具体技术方案如下：

3、本发明提供一种猫传染性腹膜炎病毒的纯化方法，包括如下步骤：

4、1)制备猫传染性腹膜炎病毒培养液，低速离心去除细胞碎片，收集上清液；

5、2)向步骤1)所得上清液中加入多聚甲醛至其终浓度为1-3％w/v，4℃固定1-2h，得到处理后病毒液；

6、3)将步骤2)所得处理后病毒液加入至第一蔗糖密度梯度中，自下而上依次为50％w/v 的蔗糖溶液、20％w/v的蔗糖溶液和步骤2)所得处理后病毒液，进行第一次密度梯度离心，离心后，吸取病毒溶液；

7、4)将步骤3)所得病毒溶液加入至第二蔗糖密度梯度中，自下而上依次为30％w/v的蔗糖溶液、20％w/v的蔗糖溶液、10％w/v的蔗糖溶液和步骤3)所得病毒溶液，进行第二次密度梯度离心，重悬所得病毒，得到病毒重悬液；

8、5)步骤3)所得病毒重悬液进行连续换液脱糖，浓缩后，即得纯化后病毒。

9、进一步地，步骤3)和步骤4)中所述蔗糖溶液为蔗糖的hepes溶液。

10、进一步地，所述hepes溶液的配方为：0.9％w/vnacl，10mm hepes，ph6.7。

11、进一步地，步骤3)中所述50％的蔗糖溶液、20％的蔗糖溶液和步骤2)所得处理后病毒液的体积比为1:1:5.7；

12、优选地，步骤3)中所述50％的蔗糖溶液、20％的蔗糖溶液和步骤2)所得处理后病毒液的体积分比为5ml、5ml和28.5ml。

13、进一步地，步骤4)中所述30％的蔗糖溶液、20％的蔗糖溶液、10％的蔗糖溶液和步骤3) 所得病毒溶液的体积比为1:1:1:1.8125；

14、优选地，步骤4)中所述30％的蔗糖溶液、20％的蔗糖溶液、10％的蔗糖溶液和步骤3) 所得病毒溶液的体积分别为8ml、8ml、8ml和14.5ml。

15、进一步地，步骤1)中所述低速离心的转速为400-1000rpm，时间为30-60min。

16、进一步地，步骤3)中所述第一次密度梯度离心于60,000-80,000g 4℃离心1-2h；

17、步骤3)中所述第二次密度梯度离心于80,000-10,000g 4℃离心2-3h。

18、本发明还提供上述纯化方法所纯化得到的猫传染性腹膜炎病毒。

19、本发明还提供上述纯化方法或所得猫传染性腹膜炎病毒在结构生物学研究中的用途。

20、本发明还提供上述纯化方法或所得猫传染性腹膜炎病毒在制备猫传染性腹膜炎病毒疫苗中用途。

21、本发明的有益效果为：

22、本发明提供一种猫传染性腹膜炎病毒的纯化方法，其基于两次密度梯度超速离心进行 fipv的纯化，在去除病毒培养液中的细胞碎片后，首先通过第一次密度梯度离心超速离心对病毒颗粒进行富集与浓缩，收集浓缩后的病毒颗粒后，再进行第二次密度梯度超速离心，以达到纯化的效果。此外，多聚甲醛对病毒进行固定，使病毒更容易保留稳定的结构信息，用于后续的结构生物学观察。本发明方法较目前常用的其他纯化方法，具有操作简单、成本较低、操作过程温和、病毒颗粒损耗率低等优点，适合猫传染性腹膜炎病毒的规模化纯化，能够尽可能的保证fipv病毒颗粒的完整性，非常适合应用于结构生物学(冷冻电镜)研究，并且也可为应用于疫苗开发的fipv纯化问题提供参考依据。