一种基因修饰研究方案及应用的制作方法

1.本发明属于基因表观修饰研究领域，具体涉及一种基因组5mc甲基化修饰的研究方案及其应用。


背景技术：

2.解析真核细胞基因转录调控的过程和分子机制，是分子生物学研究的中心课题之一。除了顺式作用元件、反式作用因子这些传统的表达调控单元以外，近年来的研究发现基因组dna的表观修饰调控与转录过程密切相关，这也是当前基因表达调控研究的一个重要方向。在真核细胞基因组中，dna甲基化主要发生在胞嘧啶碱基的第5位碳原子上，常以cpg二核苷酸序列的5mc甲基化修饰的形式出现。
3.与顺式作用元件、反式作用因子相比，基因组dna的表观修饰调控具有更强的动态性，这主要是因为细胞内存在大量的表观修饰酶，如5mc writer、5mc eraser和5mc reader。5mc writer是催化甲基供体与胞嘧啶残基结合，形成5mc修饰的的核酸转移酶；5mc eraser是负责去除5mc中的甲基基团的核酸转移酶；5mc reader能识别5mc修饰碱基并与之结合，进而发挥修饰作用的生物学活性的一大类蛋白因子。这三类表观修饰因子相互协同，维持高度动态化的基因组5mc修饰，也是其发挥生物学功能的重要基础。
4.从作用机制上来看，dna甲基化可以理解为叠加在基因序列之上的一种调控方式。比如，对顺式作用元件的某些关键位点的5mc修饰，能抑制对甲基化敏感的反式作用因子的识别与结合，进而发挥调节基因表达的作用。此外，甲基化的dna还可以招募转录抑制性的mcpg结合蛋白，影响基因转录。
5.为了发现5mc甲基化的修饰位点，亚硫酸氢盐转化是最常用的研究方案。用亚硫酸氢盐处理基因组dna，会使未甲基化的胞嘧啶核苷脱去氨基，生成尿嘧啶核苷；在随后的pcr扩增中，尿嘧啶核苷会被读作胸腺嘧啶核苷，产生胞嘧啶核苷
→
胸腺嘧啶核苷的转化。对于甲基化的胞嘧啶核苷(5mc)，由于其能抵抗亚硫酸氢盐的转化作用，在随后的pcr扩增中会被读作胞嘧啶核苷，产生甲基化胞嘧啶核苷
→
胞嘧啶核苷的转换。这样，通过对比亚硫酸氢盐处理前、后基因组序列的改变，就能发现其中被甲基化的胞嘧啶核苷位点。该方案的局限在于，亚硫酸氢盐处理会带来一定程度的dna损伤或断裂，这使得长片段扩增非常困难，通常只能获得100-300bp的短基因组片段供后续分析。
6.在5mc研究中，通常将亚硫酸氢盐转化与“sanger测序”或“全基因组测序”结合使用。“亚硫酸氢盐/sanger”测序方案是一种低通量的研究手段，适合研究小范围内的5mc修饰情况。“亚硫酸氢盐/全基因组”测序方案则能在全基因组范围内解析5mc修饰的存在及变化，是该领域研究的“金标准”。
7.在过去的十年中，随着“亚硫酸氢盐/全基因组”测序方案的广泛应用，泛基因组水平的研究取得了长足的发展。随着研究数据的积累，人们发现肿瘤组织常常在泛基因组水平出现5mc高甲基化、或低甲基化的现象。由于这两种完全相反的调控模式会出现在同一类型的不同肿瘤中，使得从泛基因组水平来理解5mc修饰对肿瘤发生的意义变得极为困难。越
来越多的研究数据指出，泛基因组水平的dna甲基化调控更可能是肿瘤发生的结果，而非原因。这种认识上的进步也推动5mc研究从泛基因组水平向某些关键的“目标基因组区域”聚焦。


技术实现要素：

8.在基因表达调控过程中，启动子区域发挥了重要的作用。通常情况下，一个基因的启动子区域的长度在2kb左右，其中存在大量以局部聚集状态分布的cpg二核苷酸序列，被称作“cpg岛”，这也是5mc修饰作用的关键位点。这样，研究表观修饰对基因表达调控的作用，就需要系统解析启动子区域的所有表观修饰位点、以及它们在基因表达调控过程中的变化。
9.对现有技术来说，“亚硫酸氢盐/sanger”测序方案仅适合研究较短的基因组片段，而“亚硫酸氢盐/全基因组”测序方案又不能聚焦于局部区域，都不适合研究2kb左右的启动子区域。
10.为了克服这些不足，本发明将“亚硫酸氢盐/sanger”和“亚硫酸氢盐/全基因组”方案的优点进行了有机结合，建立了“可聚焦的高通量甲基化”研究方案。该方案的优势在于：1、利用多片段pcr扩增，实现对较长的“目标基因组区域”的聚焦和全覆盖；2、引入多重序列标签，实现对多样品的并行建库和测序，减少了工作量，降低了研究成本；3、通过对目标基因组区域的“局部聚焦”，提高了测序数据的利用率，进一步降低了测序成本。
11.本发明的有益效果
12.本发明提供的“可聚焦的高通量甲基化”研究方案，可兼顾高检测通量和局部聚焦的问题，能在一次实验中完成对数kb长的基因组区域的5mc定量分析，适合对关键的局部序列的表观修饰研究。此外，该研究方案还能够极大地提高测序数据的利用率。以人类基因组30亿(3
×
109)碱基对的测序长度计算，对于2kb(2
×
103)长的基因启动子区域(目标基因组区域)而言，数据利用率仅有6.7
×
10-7。换句话说，当需要达到同样的测序深度时，与“亚硫酸氢盐/全基因组”测序方案相比，本发明提供的研究方案能将测序数据利用率提高1.49
×
106倍。
具体实施方式
13.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验，通常按照常规的实验条件，如分子克隆：实验室手册(newyork:cold spring harbor laboratory press，1989，sambrook等人著)中所描述的实验条件，或按照设备或试剂盒制造厂商建议的实验条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均进行三次独立的重复实验。
14.实施例一、可聚焦的高通量5mc甲基化修饰位点检测方案
15.本实施例以人子宫内膜癌细胞hhua为研究对象，以孕激素受体基因的启动子为目标基因组区域，利用“可聚焦的高通量甲基化”研究方案对5mc修饰位点开展研究。
16.孕激素是女性体内一种重要性激素。它通过结合细胞核内的孕激素受体，激活下游信号通路，进而发挥多种生理作用。孕激素受体基因(pr)是孕激素信号通路中关键的节
点分子，包括prb、pra两个主要的受体蛋白亚型，这两个亚型蛋白由同一个基因序列所编码。在相距1kb左右的两个启动子的独立驱动下，孕激素受体基因能够分别表达prb、pra两个亚型的受体蛋白，其中prb是一个具有完整基因结构的蛋白质，而pra则是一种n端截短型的蛋白质。由于n端结构域的缺失，prb、pra受体蛋白在功能上出现拮抗性，这使得该基因呈现出一种独特的功能调节模式——pr亚型转换调节。细胞通过调节prb/pra的相对表达水平，影响其对孕激素的反应性，实现细胞个体化的孕激素功能调节。
17.为了研究pr启动子的表观修饰、以及对基因表达的影响，我们利用“可聚焦的高通量甲基化”研究方案，对跨度4.8kb的pr基因泛启动子区域进行了分析。序列分析表明，该区域内共存在252个cpg二核苷酸序列。
18.研究方案的实验流程具体如下。
19.1、基因组dna的提取
20.在含有10％小牛血清的dmem培养液中，培养人子宫内膜癌hhua细胞。收获培养细胞，利用天根生化科技有限公司提供的“血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒”，提取细胞基因组dna。对提取的基因组dna进行定量，将dna浓度调整为500ng/ul。
21.从培养细胞中提取基因组dna，是本发明提供的“可聚焦的高通量甲基化”研究方案中获得检测样本的一种方法。可以理解，适合该研究方案的获得被检测基因组dna的其他方法还有：从离体的组织中提取基因组dna，从石蜡包埋的组织中提取基因组dna，等等。
22.2、基因组dna的亚硫酸氢盐转化
23.利用zymo research公司提供的ez dna methylation-gold试剂盒，进行对基因组dna的亚硫酸氢盐转化。具体的，取2ug基因组dna，按试剂盒的操作方法进行亚硫酸氢盐转化处理。对转化后的dna样本进行定量，将浓度调整为100ng/ul。
24.3、目标dna片段的富集和纯化
[0025]“亚硫酸氢盐/全基因组”测序是目前5mc研究的金标准，能够在全基因组范围内解析5mc修饰的存在及变化。但就局部的目标基因组区域而言，比如4.8kb长的pr泛启动子区域，测序数据的利用率非常低，经济性极差。为了提高数据利用率，降低研究成本，本发明提出在完成亚硫酸氢盐对基因组dna的转化处理以后，将研究向目标基因组区域进行“聚焦”。换句话说，利用pcr扩增、基因定向克隆等手段，获得能覆盖目标基因组区域的一组目标dna片段，降低测序模板的复杂程度。
[0026]
将4826个碱基长的pr泛启动子区域(目标基因组区域)的序列命名为pr promoter(seq id no:0001)，具体如下。以蛋白编码序列起始位点atg(下划线标记序列)的a为0号位置，对4826个核苷酸残基进行编号；这样，5’端的第一个碱基g(粗体标记)的编号为-1954，3’端最后一个碱基g(粗体标记+下划线标记)的编号为+2871。
[0027]
[0028]
[0029][0030]
文献研究表明，亚硫酸氢盐处理会对基因组dna造成损伤，导致扩增片段的长度一般在100-300bp。考虑到这种情况，我们将4826个碱基的目标基因组区域分为27段，分段设计了巢式pcr扩增方案，对27个目标dna片段进行独立扩增，以实现对目标基因组区域的全覆盖。
[0031]
对27个目标dna片段进行扩增的引物序列，具体如下：
[0032]
pr-00f(seq id no:0101)5
’‑
tatttttgtgtttatatttgtttttg
[0033]
pr-01f(seq id no:0102)5
’‑
ggtttttttgtagttgttatattatat
[0034]
pr-01r(seq id no:0103)5
’‑
ccactaaaaataaaaaacctaaacccc
[0035]
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’‑
ggggtttaggttttttatttttagtgg
[0036]
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’‑
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[0037]
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’‑
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[0038]
pr-03r(seq id no:0107)5
’‑
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[0039]
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’‑
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[0040]
pr-04r(seq id no:0109)5
’‑
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[0041]
pr-05f(seq id no:0110)5
’‑
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[0042]
pr-05r(seq id no:0111)5
’‑
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[0043]
pr-06f(seq id no:0112)5
’‑
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[0044]
pr-06r(seq id no:0113)5
’‑
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[0045]
pr-07f(seq id no:0114)5
’‑
ggtggaaatgttaattttagag
[0046]
pr-07r(seq id no:0115)5
’‑
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[0047]
pr-08f(seq id no:0116)5
’‑
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[0048]
pr-08r(seq id no:0117)5
’‑
ccctcactaaaaccctaaaactaatc
[0049]
pr-09f(seq id no:0118)5
’‑
gattagttttagggttttagtgaggg
[0050]
pr-09r(seq id no:0118)5
’‑
ctccaaaaaaattctccaacttctatc
[0051]
pr-10f(seq id no:0120)5
’‑
gatagaagttggagaatttttttggag
[0052]
pr-10r(seq id no:0121)5
’‑
ctaatcaactcctacccttaacctc
[0053]
pr-11f(seq id no:0122)5
’‑
gaggttaagggtaggagttgattag
[0054]
pr-11r(seq id no:0123)5
’‑
ccctttaccttcaactcaatcataa
[0055]
pr-12f(seq id no:0124)5
’‑
ttatgattgagttgaaggtaaaggg
[0056]
pr-12r(seq id no:0125)5
’‑
tcccaaaaaaataaatataacc
[0057]
pr-13f(seq id no:0126)5
’‑
ggttttgttagggataggatttttt
[0058]
pr-13r(seq id no:0127)5
’‑
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[0059]
pr-14f(seq id no:0128)5
’‑
gaggttattagtttttggtgtttgtttg
[0060]
pr-14r(seq id no:0129)5
’‑
aaactatctccaaccttacaccc
[0061]
pr-15f(seq id no:0130)5
’‑
gggtgtaaggttggagatagttt
[0062]
pr-15r(seq id no:0131)5
’‑
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[0063]
pr-16f(seq id no:0132)5
’‑
gtggaggttgaggaggaggatggt
[0064]
pr-16r(seq id no:0133)5
’‑
aaaatcttccttaaaaaccaaaac
[0065]
pr-17f(seq id no:0134)5
’‑
gttttggtttttaaggaagatttt
[0066]
pr-17r(seq id no:0135)5
’‑
taattaaaaaacaaaataaacac
[0067]
pr-18f(seq id no:0136)5
’‑
gtgtttattttgttttttaatta
[0068]
pr-18r(seq id no:0137)5
’‑
ccttcctcctcctcctttatcttt
[0069]
pr-19f(seq id no:0138)5
’‑
aaagataaaggaggaggaggaagg
[0070]
pr-19r(seq id no:0139)5
’‑
ctttatacaaaatacactccaaaat
[0071]
pr-20f(seq id no:0140)5
’‑
attttggagtgtattttgtataaag
[0072]
pr-20r(seq id no:0141)5
’‑
tcacctcaaataattaaaataaaac
[0073]
pr-21f(seq id no:0142)5
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[0074]
pr-21r(seq id no:0143)5
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[0075]
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[0076]
pr-22r(seq id no:0145)5
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[0077]
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[0078]
pr-23r(seq id no:0147)5
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accacctctcaaatcccacccctccc
[0079]
pr-24f(seq id no:0148)5
’‑
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[0080]
pr-24r(seq id no:0149)5
’‑
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[0081]
pr-25f(seq id no:0150)5
’‑
atattattttgtatattgaagtaatggaatg
[0082]
pr-25r(seq id no:0151)5
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ccttcctatctatatactaaatcaaaac
[0083]
pr-26f(seq id no:0152)5
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[0084]
pr-26r(seq id no:0153)5
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[0085]
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’‑
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[0086]
pr-27r(seq id no:0155)5
’‑
caccactatctaatactaaaaatttc
[0087]
pr-28r(seq id no:0156)5
’‑
ataacaacctaatacttcatccccac
[0088]
下面以对目标dna片段01的扩增为例，说明本实施例的巢式pcr扩增方案。目标dna片段01的范围为上游扩增引物pr-01f和下游扩增引物pr-01r之间的基因组序列，长度为251个碱基。目标dna片段02的范围为上游扩增引物pr-02f和下游扩增引物pr-02r之间的基因组序列，长度为273个碱基，目标dna片段03的长度为163个碱基，目标dna片段04的长度为264个碱基，目标dna片段05的长度为173个碱基，目标dna片段06的长度为146个碱基，目标dna片段07的长度为196个碱基，目标dna片段08的长度为274个碱基，目标dna片段09的长度为214个碱基，目标dna片段10的长度为164个碱基，目标dna片段11的长度为214个碱基，目标dna片段12的长度为170个碱基，目标dna片段13的长度为246个碱基，目标dna片段14的长
度为125个碱基，目标dna片段15的长度为174个碱基，目标dna片段16的长度为165个碱基，目标dna片段17的长度为143个碱基，目标dna片段18的长度为263个碱基，目标dna片段19的长度为239个碱基，目标dna片段20的长度为273个碱基，目标dna片段21的长度为179个碱基，目标dna片段22的长度为231个碱基，目标dna片段23的长度为150个碱基，目标dna片段24的长度为255个碱基，目标dna片段25的长度为248个碱基，目标dna片段26的长度为182个碱基，目标dna片段27的长度为174个碱基。
[0089]
针对目标dna片段01的序列，设计一对外侧pcr扩增引物(外侧上游扩增引物pr-00f，外侧下游扩增引物pr-02r)和一对内侧扩增引物(内侧上游扩增引物pr-01f，内侧下游扩增引物pr-01r)。首先，以经过亚硫酸氢盐处理的基因组dna作为模板，设置巢式pcr反应的外侧扩增反应体系。
[0090][0091]
其中，kod dna聚合酶为toyobo公司的产品(货号：kme-101s)。
[0092]
pcr扩增反应条件为：94℃条件下孵育2分钟；进行40个循环的pcr扩增(98℃,10sec
→
50℃,30sec
→
68℃,30sec)；68℃条件下孵育5分钟。
[0093]
随后，以10μl的外侧扩增反应产物为dna模板，设置巢式pcr反应的内侧扩增反应体系。
[0094][0095]
pcr扩增反应条件为：95℃条件下孵育2分钟；进行40个循环的pcr扩增(95℃,30sec
→
50℃,30sec
→
68℃,30sec)；68℃条件下孵育5分钟。
[0096]
将扩增产物上样到琼脂糖凝胶中，进行凝胶电泳；待扩增条带得到分离后，切胶回收目标产物条带，即为得到纯化的目标dna片段01。将目标dna片段01进行定量，将浓度调整为100ng/ul。
[0097]
按照以上描述的方法，针对目标dna片段02的序列，分别设计的一对外侧pcr扩增引物(外侧上游扩增引物pr-01f，外侧下游扩增引物pr-03r)和一对内侧扩增引物(内侧上游扩增引物pr-02f，内侧下游扩增引物pr-02r)；针对目标dna片段03的序列，设计一对外侧pcr扩增引物(外侧上游扩增引物pr-02f，外侧下游扩增引物pr-04r)和一对内侧扩增引物(内侧上游扩增引物pr-03f，内侧下游扩增引物pr-03r)；并以此类推，设计针对27个目标dna片段的巢式pcr扩增引物对。
[0098]
按照以上描述的方法，对各目标dna片段进行巢式pcr扩增和切胶回收，分别获得纯化的目标dna片段产物。对得到的目标dna片段进行定量，将浓度调整为100ng/ul。
[0099]
为了验证亚硫酸氢盐转化、以及后续扩增过程的稳定性，我们以同一批提取的基因组dna样本为对象，对多个目标dna片段进行了多次重复的转化、扩增、以及扩增片段的sanger测序。测序结果所示，与未经亚硫酸氢盐转化处理的基因组样品相比，对转化后同一片段的多次重复测序的结果是一致的，均在相同的位点检测到相似比例的5mc修饰的存在，表明实验过程是稳定可靠的。
[0100]
应当理解，除了本实施例提供的巢式pcr扩增方案以外，其他的凡是能获得对目标基因组区域全覆盖的一组目标dna片段的dna扩增、克隆方案，均可用于本发明所提供的研究方案。
[0101]
4、标签序列的添加
[0102]
为了能对不同的目标dna片段进行混合建库、测序，本发明提供的研究方案进一步在纯化的目标dna片段的5’端或3’端连接特异性的标签序列，这样就能在测序数据中区分来源于某个目标dna片段的序列。标签序列也可用于区分来源于不同样本的片段，诸如来源于不同细胞系的样本、同一细胞系经不同时间培养或不同处理过程的样本、不同肿瘤样本等，这是本发明能够降低研究成本的另一个关键改进。
[0103]
以在目标dna片段的5’端添加表圈序列为例，标签序列的5’端为保护碱基，随后是特异性身份识别序列、以及3’端的接头序列。添加5’端保护碱基的目的在于防止特异性身份识别序列在建库中丢失，添加接头序列的目的是为了方便标签序列与目标片段之间的连接。特异性身份识别序列是用于区分来源于不同样本的测序数据，以4个碱基的不同排列而言，即可用于区分来源于256种不同样本的测序数据。
[0104]
为了区分来源于pr泛启动子区域的不同目标dna片段，本实施例利用两次连续的pcr反应，分别向27个目标dna片段添加共同的接头序列和特异性的标签序列。
[0105]
用于添加接头序列的扩增引物如下：
[0106]
pr-01jf(seq id no:0201)5
’‑
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[0107]
pr-02jf(seq id no:0202)5
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[0108]
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[0109]
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[0110]
pr-05jf(seq id no:0205)5
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[0111]
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[0112]
pr-07jf(seq id no:0207)5
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[0113]
pr-08jf(seq id no:0208)5
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[0114]
pr-09jf(seq id no:0209)5
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cgccatactcaggtttacgattcggattagttttagggttttagtgaggg
[0115]
pr-10jf(seq id no:0210)5
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[0116]
pr-11jf(seq id no:0211)5
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cgccatactcaggtttacgattcggaggttaagggtaggagttgattag
[0117]
pr-12jf(seq id no:0212)5
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cgccatactcaggtttacgattcgttatgattgagttgaaggtaaaggg
[0118]
pr-13jf(seq id no:0213)5
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cgccatactcaggtttacgattcgggttttgttagggataggatttttt
[0119]
pr-14jf(seq id no:0214)5
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cgccatactcaggtttacgattcggaggttattagtttttggtgtttgtttg
[0120]
pr-15jf(seq id no:0215)5
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cgccatactcaggtttacgattcggggtgtaaggttggagatagttt
[0121]
pr-16jf(seq id no:0216)5
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cgccatactcaggtttacgattcggtggaggttgaggaggaggatggt
[0122]
pr-17jf(seq id no:0217)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcggttttggtttttaaggaagatttt
[0123]
pr-18jf(seq id no:0218)5
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cgccatactcaggtttacgattcggtgtttattttgttttttaatta
[0124]
pr-19jf(seq id no:0219)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcgaaagataaaggaggaggaggaagg
[0125]
pr-20jf(seq id no:0220)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcgattttggagtgtattttgtataaag
[0126]
pr-21jf(seq id no:0221)5
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cgccatactcaggtttacgattcggttttattttaattatttgaggtgaggg
[0127]
pr-22jf(seq id no:0222)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcggggatatagtataggggtagttgtt
[0128]
pr-23jf(seq id no:0223)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcggttgtagtttagtggggtagaaagtg
[0129]
pr-24jf(seq id no:0224)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcggggaggggtgggatttgagaggtggt
[0130]
pr-25jf(seq id no:0225)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcgatattattttgtatattgaagtaatggaatg
[0131]
pr-26jf(seq id no:0226)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcggttttgatttagtatatagataggaagg
[0132]
pr-27jf(seq id no:0227)5
’‑
cgccatactcaggtttacgattcgggtgttattgatgaatggttaattatt
[0133]
注：下划线序列为接头序列。
[0134]
用于添加特异性标签序列的扩增引物如下：
[0135]
pr01-barcode(seq id no:0301)
[0136]
pr02-barcode(seq id no:0302)
[0137]
pr03-barcode(seq id no:0303)
[0138]
pr04-barcode(seq id no:0304)
[0139]
pr05-barcode(seq id no:0305)
[0140]
pr06-barcode(seq id no:0306)
[0141]
pr07-barcode(seq id no:0307)
[0142]
pr08-barcode(seq id no:0308)
[0143]
pr09-barcode(seq id no:0309)
[0144]
pr10-barcode(seq id no:0310)
[0145]
pr11-barcode(seq id no:0311)
[0146]
pr12-barcode(seq id no:0312)
[0147]
pr13-barcode(seq id no:0313)
[0148]
pr14-barcode(seq id no:0314)
[0149]
pr15-barcode(seq id no:0315)
[0150]
pr16-barcode(seq id no:0316)
[0151]
pr17-barcode(seq id no:0317)
[0152]
pr18-barcode(seq id no:0318)
[0153]
pr19-barcode(seq id no:0319)
[0154]
pr20-barcode(seq id no:0320)
[0155]
pr21-barcode(seq id no:0321)
[0156]
pr22-barcode(seq id no:0322)
[0157]
pr23-barcode(seq id no:0323)
[0158]
pr24-barcode(seq id no:0324)
[0159]
pr25-barcode(seq id no:0325)
[0160]
pr26-barcode(seq id no:0326)
[0161]
pr27-barcode(seq id no:0327)
[0162]
注：5’端下划线序列为保护碱基，3’端下划线序列为接头序列，两者之间的粗体序列为特异性身份识别序列。
[0163]
下面以对目标dna片段01添加标签序列为例，说明标签序列的添加流程。首先以经过纯化的目标dna片段01为模板，设置如下用于添加接头序列的第一次pcr扩增反应体系。
[0164][0165][0166]
pcr扩增反应条件为：95℃条件下孵育2分钟；进行40个循环的pcr扩增(95℃,30sec
→
50℃,30sec
→
68℃,30sec)；68℃条件，孵育5分钟。
[0167]
随后，取5μl扩增产物，配置如下用于添加特异性标签序列的第二次扩增反应体系。
[0168][0169]
pcr扩增反应条件为：95℃条件下孵育2分钟；进行40个循环的pcr扩增(95℃,30sec
→
50℃,30sec
→
68℃,30sec)；68℃条件下孵育5分钟。
[0170]
利用琼脂糖凝胶电泳，对完成标签序列添加的扩增产物进行纯化、定量，将dna浓度调整为100ng/ul。
[0171]
按照以上描述的方法，对各目标dna片段进行可区分的标签序列的添加，分别获得添加了标签序列的目标dna片段产物。对得到各目标dna片段产物进行定量，将浓度均调整为100ng/ul。
[0172]
应当理解，除了本节所描述的技术方案以外，其他的利用常规的分子生物学技术，能够向目标dna片段中添加可区分的标签序列的方法，均可用于本发明提供的研究方案。这些技术方法包括且不限于dna聚合酶反应、pcr扩增、酶切、连接、质粒克隆、亚克隆、随机突变等手段。
[0173]
5、高通量测序及数据分析
[0174]
将添加了标签序列的27个目标dna片段进行等摩尔量的混合，将混合的dna样本送高通量二代测序。
1190,0.71％；-1181,0.86％；-1179,1.97％；-1170,0.66％；-1165,0.21％；-1156,91.71％；-1154,0.91％；-1151,0.95％；-1142,0.22％；-1134,0.17％；-1130,0.40％；-1128,0.45％；-1117,1.32％；-1086,33.83％；-1083,1.18％；-1082,1.49％；-1075,2.03％；-1048,2.13％；-1047,2.04％；-1040,0.74％；-1037,1.16％；-1036,1.85％；-1034,0.95％；-1023,0.42％；-1018,1.71％；-1013,0.95％；-1006,1.77％；-993,2.05％；-985,1.06％；-982,0.99％；-979,2.11％；-969,1.01％；-964,2.52％；-957,1.42％；-956,3.28％；-943,1.63％；-936,1.37％；-927,2.09％；-922,3.03％；-917,3.73％；-908,1.17％；-897,0.81％；-896,2.11％；-893,2.07％；-892,1.22％；-891,3.61％；-828,1.50％；-823,0.84％；-822,1.67％；-819,0.11％；-818,2.22％；-796,2.17％；-789,2.06％；-784,1.41％；-783,2.05％；-781,1.00％；-780,0.94％；-779,1.17％；-766,1.83％；-753,2.78％；-749,1.12％；-745,1.95％；-744,1.39％；-740,0.83％；-739,5.41％；-737,1.84％；-734,0.22％；-730,2.40％；-728,1.11％；-723,3.08％；-714,1.73％；-713,2.41％；-698,2.47％；-687,0.78％；-683,0.75％；-681,1.07％；-672,0.17％；-668,1.17％；-665,1.73％；-663,0.84％；-658,1.40％；-644,0.33％；-641,0.81％；-638,0.25％；-637,0.58％；-636,0.59％；-631,1.72％；-628,0.50％；-622,0.66％；-620,0.52％；-619,0.49％；-618,2.53％；-616,0.76％；-614,0.09％；-611,0.69％；-604,0.34％；-597,0.71％；-594,2.16％；-585,0.54％；-581,2.82％；-579,0.46％；-578,1.51％；-577,3.73％；-575,0.94％；-570,2.22％；-565,0.20％；-564,2.59％；-561,0.19％；-554,0.21％；-553,1.05％；-550,0.46％；-549,0.86％；-548,0.86％；-545,0.90％；-533,0.62％；-528,1.04％；-527,0.79％；-519,0.48％；-518,0.63％；-489,0.32％；-481,1.03％；-479,0.63％；-476,0.85％；-469,0.42％；-462,0.23％；-459,1.03％；-457,1.19％；-454,0.97％；-450,1.23％；-448,0.42％；-437,0.81％；-436,1.46％；-424,1.04％；-409,0.67％；-408,1.37％；-406,0.96％；-401,1.04％；-399,0.46％；-391,0.43％；-390,1.22％；-387,1.75％；-385,0.85％；-382,0.70％；-381,2.20％；-379,0.96％；-376,0.75％；-375,2.16％；-373,0.60％；-371,1.11％；-365,1.08％；-364,1.29％；-360,0.48％；-350,0.68％；-348,0.35％；-345,1.52％；-342,0.71％；-340,0.36％；-339,1.77％；-335,0.29％；-334,0.68％；-332,1.46％；-301,1.22％；-299,0.38％；-298,0.09％；-297,0.38％；-296,0.65％；-284,0.48％；-278,0.76％；-275,0.09％；-271,0.38％；-265,0.47％；-262,0.45％；-256,0.09％；-252,1.97％；-250,1.42％；-248,0.57％；-247,0.48％；-246,1.61％；-245,2.25％；-243,0.85％；-239,0.55％；-238,2.55％；-236,0.29％；-234,1.69％；-232,0.47％；-226,0.46％；-222,1.40％；-216,1.01％；-215,0.46％；-213,1.05％；-208,0.95％；-207,0.27％；-206,0.73％；-205,0.57％；-201,2.45％；-198,0.94％；-166,6.25％；-163,1.04％；-160,1.09％；-157,2.13％；-156,1.06％；-155,5.23％；-153,4.21％；-150,2.08％；-147,2.08％；-127,1.22％；-126,1.22％；-123,2.17％；-114,2.17％；-108,1.22％；-101,2.08％；-90,2.08％；-65,1.11％；-57,1.04％；-45,1.04％；-39,2.17％；-31,3.13％；-8,1.09％；-4,8.16％；209,9.31％；212,7.66％；220,7.03％；222,1.62％；227,0.57％；228,1.34％；231,0.73％；235,6.42％；237,0.31％；241,6.78％；245,5.68％；254,2.62％；256,1.70％；262,1.29％；263,1.66％；268,0.80％；274,0.55％；
277,0.68％；286,0.71％；293,0.54％；296,0.70％；301,0.50％；306,0.58％；307,0.57％；308,0.22％；309,0.35％；310,0.89％；320,0.65％；323,4.52％；327,0.77％；330,0.44％；335,1.61％；341,0.48％；347,1.21％；349,0.82％；351,0.35％；358,4.44％；360,0.71％；361,0.78％；362,0.43％；364,0.78％；369,0.92％；370,0.81％；371,1.67％；375,0.37％；380,0.42％；381,1.57％；384,0.55％；385,0.66％；386,1.16％；389,0.26％；390,0.46％；391,0.22％；393,0.67％；394,0.46％；395,4.38％；397,0.57％；398,0.98％；401,2.87％；527,1.28％；532,1.70％；535,1.30％；538,0.57％；541,0.29％；542,0.40％；543,1.40％；552,0.69％；555,0.34％；556,0.59％；557,0.27％；558,1.09％；563,0.70％；564,0.70％；568,1.25％；570,0.71％；571,1.91％；574,0.31％；575,0.67％；576,2.06％；579,1.04％；582,0.26％；585,0.86％；588,0.41％；590,0.72％；591,0.51％；592,1.35％；595,0.34％；596,0.78％；598,0.15％；605,0.25％；606,0.48％；607,0.77％；609,1.02％；611,0.19％；616,1.16％；617,1.93％；622,0.41％；623,1.21％；624,0.88％；625,1.65％；633,0.71％；634,2.23％；637,0.46％；639,0.59％；640,5.54％；642,1.22％；646,0.34％；647,2.61％；649,0.32％；652,3.08％；685,0.41％；686,1.83％；694,1.16％；697,0.41％；703,1.34％；716,0.34％；720,1.84％；721,1.01％；723,1.99％；727,0.34％；729,2.07％；737,3.59％；739,2.50％；742,1.84％；745,0.34％；757,0.42％；758,4.86％；760,0.34％；763,0.69％；767,0.34％；769,1.51％；772,2.40％；778,1.43％；781,0.34％；784,2.74％；791,3.07％；794,1.91％；1178,2.27％；1180,1.82％；1186,1.06％；1187,1.00％；1189,0.23％；1190,3.42％；1192,0.78％；1194,2.04％；1196,0.09％；1198,0.43％；1199,0.20％；1200,0.98％；1201,2.36％；1203,2.15％；1207,0.25％；1208,1.26％；1211,0.17％；1212,1.33％；1219,0.74％；1220,0.98％；1225,0.46％；1226,0.49％；1229,0.24％；1230,0.13％；1231,0.02％；1232,1.03％；1234,0.13％；1237,1.18％；1238,0.88％；1241,0.54％；1242,0.92％；1243,1.72％；1250,0.47％；1251,0.83％；1252,2.43％；1260,0.18％；1261,2.53％；1263,2.26％；1264,2.80％；1266,0.62％；1267,0.98％；1268,0.08％；1269,0.57％；1270,1.64％；1272,0.39％；1275,1.03％；1276,2.98％；1278,0.29％；1279,2.60％；1281,1.19％；1285,1.36％；1289,0.78％；1290,0.84％；1291,1.53％；1294,0.40％；1295,0.67％；1299,0.54％；1300,0.70％；1301,2.87％；1309,1.46％；1312,2.91％；1318,1.88％；1321,0.56％；1322,2.10％；1324,0.88％；1326,0.44％；1327,0.47％；1328,0.88％；1330,0.62％；1331,2.23％；1336,0.66％；1337,0.23％；1339,1.22％；1343,0.48％；1345,1.35％；1348,0.91％；1351,2.15％；1354,0.25％；1355,0.24％；1357,0.19％；1358,0.49％；1360,1.78％；1366,1.48％；1393,3.50％；1400,1.79％；1402,2.52％；1404,1.92％；1405,2.93％；1407,0.76％；1408,0.76％；1409,0.14％；1410,0.73％；1413,1.00％；1418,0.14％；1419,0.18％；1420,0.47％；1424,2.68％；1426,2.67％；1428,0.10％；1429,3.05％；1431,0.91％；1432,1.40％；1434,2.07％；1435,0.10％；1436,1.19％；1439,0.18％；1444,1.76％；1446,0.95％；1447,1.90％；1451,1.75％；1453,0.77％；1457,1.86％；1460,0.75％；1463,1.00％；1464,1.62％；1467,0.62％；1469,1.19％；1470,0.25％；1471,1.52％；1473,1.26％；1478,1.86％；1481,0.43％；1482,1.58％；1485,0.18％；1486,0.11％；1487,1.17％；1489,0.27％；1490,0.46％；1492,0.08％；1493,0.73％；1495,0.60％；1496,
1.24％；1498,0.32％；1499,0.64％；1501,1.11％；1504,0.43％；1505,3.18％；1507,0.23％；1508,3.68％；1510,1.73％；1511,3.33％；1513,0.31％；1514,2.32％；1519,1.95％；1522,0.25％；1523,0.89％；1524,0.51％；1525,0.69％；1526,1.42％；1528,1.68％；1530,0.78％；1532,0.05％；1535,0.19％；1536,0.86％；1537,0.87％；1540,0.73％；1542,0.82％；1544,1.50％；1547,0.80％；1548,1.68％；1550,1.04％；1553,2.48％；1557,0.23％；1559,0.11％；1560,0.58％；1561,2.19％；1563,0.93％；1566,0.73％；1568,1.73％；1571,0.21％；1574,0.61％；1575,0.92％；1579,1.17％；1580,2.49％；1582,1.49％；1583,2.69％；1587,0.01％；1644,0.76％；1645,0.97％；1646,3.10％；1651,2.84％；1656,2.10％；1658,3.80％；1660,2.14％；1661,1.97％；1662,2.57％；1665,2.53％；1667,2.93％；1670,0.89％；1671,3.69％；1680,3.76％；1685,1.22％；1686,4.87％；1692,3.34％；1695,4.53％；1698,3.59％；1701,1.03％；1702,3.61％；1704,1.48％；1705,2.54％；1708,1.94％；1709,1.11％；1710,1.11％；1712,1.11％；1715,1.02％；1716,1.25％；1717,1.40％；1718,1.02％；1721,0.78％；1722,1.43％；1723,0.70％；1724,1.91％；1727,3.76％；1729,1.98％；1731,1.37％；1732,4.71％；1734,1.24％；1737,2.98％；1739,1.04％；1741,0.77％；1742,0.90％；1743,1.35％；1744,4.36％；1749,4.73％；1752,1.67％；1753,8.15％；1766,3.53％；1769,1.48％；1796,0.90％；1798,0.89％；1801,0.45％；1807,0.45％；1812,0.45％；1814,0.45％；1833,1.43％；1854,0.45％；1866,0.45％；1870,0.45％；1871,0.45％；1873,0.45％；1874,1.02％；1882,0.45％；1909,1.02％；1910,0.93％；1915,1.02％；1918,0.46％；1919,0.93％；1926,4.83％；1931,0.47％；1936,0.93％；1937,2.08％；1940,2.11％；1941,1.42％；1943,2.83％；1953,0.97％；1960,0.50％；1963,1.35％；1965,2.85％；1967,0.52％；1973,0.54％；1974,2.72％；2001,2.63％；2003,4.55％；2006,6.48％；2049,1.92％；2089,2.63％；2090,2.63％；2098,4.55％；2125,0.86％；2128,0.68％；2129,1.27％；2134,0.39％；2135,1.49％；2141,0.85％；2144,1.30％；2146,0.83％；2147,2.12％；2150,0.48％；2164,0.97％；2166,0.82％；2169,1.23％；2175,0.48％；2177,0.94％；2184,0.71％；2193,0.16％；2195,1.54％；2213,1.24％；2215,1.63％；2232,0.80％；2245,3.35％；2247,1.21％；2248,0.39％；2252,1.40％；2254,0.40％；2257,0.89％；2262,1.55％；2264,0.68％；2265,4.10％；2271,0.27％；2281,0.49％；2285,0.60％；2290,1.69％；2292,0.24％；2295,0.84％；2311,0.63％；2367,0.35％；2369,0.86％；2380,0.31％；2397,1.60％；2402,0.55％；2408,1.33％；2420,1.33％；2425,0.39％；2436,0.20％；2440,0.86％；2446,0.55％；2450,1.21％；2460,0.55％；2469,0.87％；2488,0.38％；2490,0.42％；2495,0.35％；2496,0.40％；2501,0.42％；2506,0.25％；2513,0.79％；2514,1.21％；2517,3.63％；2521,0.79％；2530,1.09％；2531,1.59％；2535,0.56％；2536,3.07％；2572,0.96％；2577,0.30％；2582,0.62％；2589,0.32％；2595,0.96％；2606,0.62％；2634,0.64％；2635,0.96％；2642,0.32％；2643,3.11％；2662,0.64％；2674,4.66％；2676,0.94％；2688,0.95％；2727,0.61％；2742,0.56％；2748,11.91％；2756,0.56％；2763,1.12％；2781,0.56％；2799,3.56％；2817,0.61％；2820,2.31％；2824,0.57％；2826,1.12％；2827,1.69％；2828,1.17％；2837,0.61％。
[0179]
研究结果表明，本发明提供的技术方案能够很好的将测序数据聚焦于基因组的局部区域，大大提高了测序数据的利用率，降低了研究的成本。
[0180]
5、检测prb、pra基因亚型的表达水平
[0181]
为了研究启动子甲基化对prb、pra亚型蛋白表达的意义，我们进一步分析了hhua细胞中prb亚型蛋白的表达水平、以及prb/pra亚型蛋白的总表达水平。
[0182]
具体的，收集培养的hhua细胞，利用trizol法提取细胞总rna。对rna样本进行定量，利用诺唯赞公司hiscript ii qrt supermix for qpcr试剂盒，将细胞rna进行逆转录，制备cdna产物。以逆转录体系获得的cdna为模板，配置如下qpcr反应体系。
[0183][0184]
其中，β-actin上游扩增引物(seq id no:0601)，5
’‑
gagcacagagcctcgccttt；β-actin下游扩增引物(seq id no:0602)，5
’‑
atccttctgacccatgccca；prb上游扩增引物(seq id no:0603)，5
’‑
actgagctgaaggcaaagggt；prb下游扩增引物(seq id no:0604)，5
’‑
gtcctgtccctggcagggc；prb/pra上游扩增引物(seq id no:0605)，5
’‑
gagttgtgagagcactggatgct；prb/pra下游扩增引物(seq id no:0606)，5
’‑
gcttagggcttggctttcatt。2
×
taq master mix购自天根生化科技公司。
[0185]
pcr扩增反应条件为：95℃条件下孵育1分钟；进行50个循环的pcr扩增(95℃,20sec
→
60℃,20sec
→
72℃,40sec)；72℃条件下孵育5分钟。每个反应设置3个复孔。
[0186]
根据扩增曲线，对三个复孔检测到的ct值如下：
[0187][0188]
利用delta delta ct法，对目标扩增产物、以及内参β-actin的含量进行定量分析。发现hhua细胞中prb/pra两个亚型蛋白的总和表达水平要显著高于prb亚型蛋白的表达水平，换句话说pra亚型蛋白的表达水平要显著高于prb亚型蛋白的表达水平。这个研究结果提示与pra基因的表达水平相比，prb启动子区域的高甲基化可能导致了该亚型表达的相对抑制。
[0189]
实施例二、内膜癌细胞系kle的pr泛启动子区域甲基化分析
[0190]
以人子宫内膜癌细胞kle为研究对象，我们进一步开展了本实施例研究。利用本发明提供的“可聚焦的高通量甲基化”研究方案，分析pr泛启动子区域的5mc修饰情况。
[0191]
研究方案的实验流程具体如下。
[0192]
1、细胞基因组dna的提取
[0193]
按照实施例一描述的方法，提取kle细胞的基因组dna。
[0194]
2、基因组dna的亚硫酸氢盐转化
[0195]
按照实施例一描述的方法，对kle细胞的基因组dna进行亚硫酸氢盐转化处理。对转化后的基因组dna进行定量，将浓度调整为100ng/ul。
[0196]
3、目标dna片段的初步富集
[0197]
按照实施例一描述的巢式pcr的外侧扩增反应，进行目标dna片段的初步富集。以目标dna片段01的初步富集为例，说明实验过程。以经过亚硫酸氢盐处理的基因组dna作为模板，设置如下扩增反应体系。
[0198][0199]
其中，kod dna聚合酶为toyobo公司的产品(货号：kme-101s)。
[0200]
pcr扩增反应条件为：94℃条件下孵育2分钟；进行40个循环的pcr扩增(98℃,10sec
→
50℃,30sec
→
68℃,30sec)；68℃条件下孵育5分钟。
[0201]
4、标签序列的添加
[0202]
以步骤3的扩增反应产物为模板，设置添加标签序列的扩增反应体系。
[0203]
用于添加特异性标签序列的扩增引物如下：
[0204]
pr01-barcode2(seq id no:0501)
[0205]
pr02-barcode2(seq id no:0502)
[0206]
pr03-barcode2(seq id no:0503)
[0207]
pr04-barcode2(seq id no:0504)
[0208]
pr05-barcode2(seq id no:0505)
[0209]
pr06-barcode2(seq id no:0506)
[0210]
pr07-barcode2(seq id no:0507)
[0211]
pr08-barcode2(seq id no:0508)
[0212]
pr09-barcode2(seq id no:0509)
[0213]
pr10-barcode2(seq id no:0510)
[0214]
pr11-barcode2(seq id no:0511)
[0215]
pr12-barcode2(seq id no:0512)
[0216]
pr13-barcode2(seq id no:0513)
[0217]
pr14-barcode2(seq id no:0514)
[0218]
pr15-barcode2(seq id no:0515)
[0219]
pr16-barcode2(seq id no:0516)
[0220]
pr17-barcode2(seq id no:0517)
[0221]
pr18-barcode2(seq id no:0518)
[0222]
pr19-barcode2(seq id no:0519)
[0223]
pr20-barcode2(seq id no:0520)
[0224]
pr21-barcode2(seq id no:0521)
[0225]
pr22-barcode2(seq id no:0522)
[0226]
pr23-barcode2(seq id no:0523)
[0227]
pr24-barcode2(seq id no:0524)
[0228]
pr25-barcode2(seq id no:0525)
[0229]
pr26-barcode2(seq id no:0526)
[0230]
pr27-barcode2(seq id no:0527)
[0231]
注：5’端下划线序列为保护碱基，粗体序列为特异性身份识别序列，3’端下划线序列为目标dna片段的同源序列。
[0232]
具体的，以步骤3的扩增反应产物10μl为模板，设置如下反应体系。
[0233][0234]
pcr扩增反应条件为：95℃条件下孵育2分钟；进行40个循环的pcr扩增(95℃,30sec
→
50℃,30sec
→
68℃,30sec)；68℃条件，孵育5分钟。
[0235]
将扩增产物上样到琼脂糖凝胶中，进行凝胶电泳；待扩增条带得到分离后，切胶回收目标产物条带，即为得到纯化的添加了标签序列的目标dna片段01。将目标dna片段01进行定量，将浓度调整为100ng/ul。
[0236]
按照以上描述的方法，对各目标dna片段进行可区分的标签序列的添加，分别获得添加了标签序列的目标dna片段产物。对得到各目标dna片段产物进行定量，将浓度均调整为100ng/ul。
[0237]
5、高通量测序及数据分析
[0238]
按照实施例一描述的方法，将添加了标签序列的27个目标dna片段进行等摩尔量的混合，将混合的dna样本送高通量二代测序。
[0239]
分析测序数据，计算所有c位点的甲基化水平。结果具体如下，结果表述格式为：5mc修饰位点的位置，5mc修饰比例。比如第一项
“‑
1927,0.37％”表示位置编号为-1927的c的修饰比例为0.37％。
[0240]-1927,0.37％；-1926,0.69％；-1923,1.54％；-1922,3.35％；-1913,1.07％；-1912,2.55％；-1911,93.39％；-1904,1.40％；-1900,0.76％；-1895,0.75％；-1894,1.35％；-1891,0.77％；-1888,1.16％；-1887,1.41％；-1886,2.66％；-1879,1.19％；-1877,1.44％；-1872,0.72％；-1871,1.67％；-1867,0.96％；-1866,1.56％；-1864,1.03％；-1860,1.08％；-1857,0.97％；-1856,1.73％；-1852,0.88％；-1849,0.90％；-1848,4.17％；-1846,1.71％；-1841,0.70％；-1830,0.96％；-1821,1.48％；-1814,0.83％；-1808,1.40％；-1805,1.35％；-1804,3.49％；-1801,0.96％；-1799,1.24％；-1798,3.21％；-1793,1.96％；-1792,2.33％；-1785,2.33％；-1784,1.31％；-1780,1.84％；-1762,1.19％；-1760,4.15％；-1758,1.40％；-1756,1.34％；-1749,0.62％；-1748,1.09％；-1747,2.18％；-1746,1.29％；-1744,0.96％；-1743,0.88％；-1742,1.12％；-1741,2.32％；-1733,86.66％；-1703,0.78％；-1701,1.05％；-1700,1.12％；-1699,1.12％；-1698,1.83％；-1697,3.34％；-1695,2.18％；-1694,1.44％；-1691,0.60％；-1684,0.84％；-1681,0.95％；-1678,3.06％；-1674,0.98％；-1667,1.89％；-1652,1.80％；-1644,2.17％；-1638,1.55％；-1636,2.22％；-1633,1.24％；-1628,2.15％；-1627,1.89％；-1619,1.02％；-1618,1.20％；-1615,1.42％；-1603,1.85％；-1598,2.08％；-1594,4.84％；-1592,2.89％；-1590,1.49％；-1580,2.23％；-1551,1.92％；-1550,1.76％；-1549,3.15％；-1542,0.90％；-1535,1.49％；-1529,2.89％；-1519,1.26％；-1511,1.47％；-1496,2.99％；-1489,0.31％；-1486,1.35％；-1485,2.59％；-1457,90.84％；-1450,1.83％；-1449,3.57％；-1438,1.38％；-1436,2.06％；-1424,1.35％；-1419,2.40％；-1415,1.43％；-1390,1.19％；-1385,2.41％；-1382,2.74％；-1379,1.54％；-1377,2.13％；-1374,1.10％；-1354,3.04％；-1352,6.91％；-1321,0.75％；-1320,1.67％；-1311,1.45％；-1304,0.88％；-1291,0.83％；-1289,2.68％；-1285,0.75％；-1284,1.50％；-1277,0.64％；-1272,57.35％；-1262,1.13％；-1260,3.84％；-1258,2.21％；-1255,1.59％；-1252,0.31％；-1251,3.58％；-1247,0.13％；-1244,1.31％；-1243,1.67％；-1240,0.82％；-1232,1.12％；-1221,1.25％；-1220,1.78％；-1217,0.33％；-1215,2.53％；-1214,0.46％；-1213,1.51％；-1211,0.81％；-1209,0.64％；-1208,0.70％；-1207,2.13％；-1200,0.20％；-1194,2.22％；-1192,94.31％；-1190,0.58％；-1181,1.42％；-1179,1.59％；-1170,0.76％；-1165,0.48％；-1156,92.06％；-1154,2.12％；-1151,1.54％；-1142,1.14％；-1134,1.09％；-1130,2.51％；-1128,0.23％；-1117,1.14％；-1086,28.01％；-1083,2.19％；-1082,1.70％；-1075,1.68％；-1048,1.23％；-1047,2.78％；-1040,1.47％；-1037,1.26％；-1036,1.49％；-1034,1.78％；-1023,1.23％；-1018,2.00％；-1013,0.98％；-1006,1.65％；-993,1.42％；-985,1.62％；-982,1.39％；-979,1.38％；-969,1.37％；-964,1.60％；-957,1.03％；-956,3.88％；-943,2.54％；-936,0.82％；-927,2.66％；-922,2.65％；-917,5.02％；-908,1.05％；-897,1.22％；-896,2.61％；-893,1.26％；-892,1.64％；-891,3.33％；-828,1.11％；-823,0.82％；-822,0.75％；-819,1.07％；-818,3.14％；-796,2.35％；-789,5.55％；-784,0.50％；-783,0.92％；-781,0.29％；-780,0.72％；-779,0.43％；-766,2.81％；-753,1.22％；-749,1.35％；-745,0.43％；-744,2.63％；-740,1.84％；-739,4.86％；-737,0.82％；-734,1.94％；-730,1.38％；-728,
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[0241]
本实施例的研究结果表明，本发明提供的技术方案能够在单碱基水平检测基因组dna的甲基化状态。