一种志贺毒素B亚基与抗原偶联物及其制备方法与应用

一种志贺毒素b亚基与抗原偶联物及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤靶向治疗药物和免疫治疗领域，具体涉及志贺毒素b亚基与抗原偶联物及其制备方法与应用，具体是在靶向瘤免疫治疗中的应用。


背景技术：

2.肿瘤相关糖类抗原是一类与肿瘤发生发展紧密相关的糖类抗原，研究证明这类抗原在多种肿瘤细胞表面呈现异常的高度表达，是一类具有巨大潜力的肿瘤生物标志物和肿瘤免疫治疗靶点。常见的肿瘤相关糖类抗原包括gb3、gb4、gd2、gd3、gm2、gm3、globo-h、tn、stn、tf、slea、slex、ley。
3.以鞘糖脂gb3为例，其是一种中性的糖类抗原，其结构为gal1-4gal1-4glc-cer。gb3糖类抗原在多肿瘤细胞表面过度表达，包括结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺等，是肿瘤早期诊断和靶向肿瘤药物开发的一个潜在靶点。由于糖类抗原具有低免疫原性，通常难以获得高亲和力的gb3单克隆抗体，尚没有以gb3为靶点的单克隆抗体用于相关肿瘤的治疗研究。志贺毒素b亚基是一种天然的凝集素蛋白，其可以特异性的结合肿瘤细胞gb3抗原。志贺毒素b亚基无毒性，且具有较低的免疫原性，可作为理想的gb3靶向分子。体进行肿瘤治疗。志贺毒素b亚基蛋白具有天然的五聚体结构，每个亚基含有5个gb3糖抗原结合位点，整个五聚体具有15个gb3结合位点，能与gb3糖抗原形成纳摩尔级别的亲和力。志贺毒素b亚基蛋白包括志贺毒素1b亚基和志贺毒素2b亚基。志贺毒素b亚基蛋白作为靶向载体已经被应用于开发免疫毒素药物、靶向药物递送系统、肿瘤细胞成像，目前尚没有用于肿瘤免疫治疗的报道。
4.内源性抗体是广泛天然存在于人体中的抗体，如针对鼠李糖半抗原、2，4二硝基苯半抗原、α-1，3-半乳糖半抗原等的内源性抗体在多数人群中具有较高的丰度。已有研究报道，可以通过构建半抗原与肿瘤细胞靶向配体的偶联物，其可以有将内源性抗体引导至特定的肿瘤细胞表面，并借助内源性抗体的免疫效应功能杀伤肿瘤细胞，从而达到肿瘤免疫治疗的目的。研究表明，通过构建含有多个半抗原或肿瘤细胞靶向配体的偶联物可以进一步增强其免疫杀伤活性。目前相关研究多采用天然聚合物、合成聚合物等大分子构建抗体募集偶联物，其制备难度大、成本高、药物均一性差，很难广发以用于肿瘤的临床治疗。
5.本发明中利用志贺毒素b亚基的天然五聚体结构作为肿瘤靶向分子，将其与半抗原鼠李糖等形成的抗体结合分子模块偶联形成含有多价鼠李糖的偶联物，可以在有效结合肿瘤细胞表面包括gb3、gb4、gb2、gd2、gd3、gm2、gm3、globo-h、tn、stn、tf、slea、slex、ley等糖类抗原的同时，引导体内鼠李糖抗体通过免疫效应功能杀伤肿瘤细胞。


技术实现要素：

6.发明目的：设计一种能够靶向gb3、gb4、gb2、gd2、gd3、gm2、gm3、globo-h、tn、stn、tf、slea、slex、ley等糖类抗原的抗体结合分子，该分子具有引导体内抗体抑制肿瘤生长的作用，是一种有效的肿瘤免疫治疗候选药物分子。
7.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
8.本发明的第一个目的是，提供一种偶联物，该偶联物是一种靶向肿瘤gb3、gb4、gb2、gd2、gd3、gm2、gm3、globo-h、tn、stn、tf、slea、slex、ley等糖类抗原的抗体结合分子，由以下两个部分偶联形成：
9.a、志贺毒素b亚基重组蛋白，所述志贺毒素b亚基重组蛋白的氨基酸序列如seq2或seq 4所示，或所述志贺毒素b亚基重组蛋白由志贺毒素b亚基蛋白经羧基端修饰获得，所述羧基端修饰为：在所述志贺毒素b亚基蛋白的羧基端修饰myc标签、转肽酶a识别位点、his标签序列；
10.b、抗体结合分子模块，所述抗体结合分子模块为在结合分子的一侧依次连接peg链接臂、甘氨酸形成的功能模块，所述结合分子为抗原或其衍生物的功能分子，或者含有抗原或其衍生物的载体的功能分子，所述抗原为具有体内抗体结合功能的分子，包括完全抗原或半抗原。
11.本发明中，抗体结合分子模块还可以理解为抗体结合分子功能模块，或抗体结合配体，意为以具有体内抗体结合功能的分子为基础的功能模块。
12.在本发明的一些实施例中，所述偶联物的结构如下：
13.ggg-peg
n-rhamnose(n＝1、3、6)
[0014][0015]
其中n＝1、3、6。
[0016]
在本发明的一些实施例中，所述志贺毒素b亚基蛋白包括志贺毒素1b亚基蛋白和志贺毒素2b亚基蛋白。
[0017]
在本发明的一些实施例中，所述志贺毒素1b亚基重组蛋白的氨基酸序列如seq 2所示，编码所述志贺毒素1b亚基重组蛋白的核苷酸序列如seq 3所示。
[0018]
在本发明的一些实施例中，所述志贺毒素2b亚基重组蛋白的氨基酸序列如seq 4所示，编码所述志贺毒素2b亚基重组蛋白的核苷酸序列如seq 5所示。
[0019]
在本发明的一些实施例中，所述半抗原包括鼠李糖、2，4二硝基苯、α-1，3-半乳糖其中任意一种。
[0020]
在本发明的一些实施例中，所述完全抗原包括多肽抗原、多肽抗原衍生物、蛋白质多糖其中任意一种。
[0021]
在本发明的一些实施例中，所述含有抗原或其衍生物的载体为含有抗原的脂质体载体，包括脂质聚合物、多糖聚合物、蛋白质载体、多肽载体其中任意一种。
[0022]
本发明中的结合分子可以是半抗原(也叫非完全抗原)、半抗原衍生物，也可以是含有半抗原或其衍生物的载体；还可以是其它完全抗原，比如多肽抗原、多肽抗原的衍生物、蛋白质多糖等其它具有类似鼠李糖的体内天然抗体结合功能的分子，以及完全抗原的衍生物，以及含有完全抗原或其衍生物的载体，这些都具有这种类似于半抗原的结合功能，只要发挥同样的功能的结合分子，都属于本发明的保护范围。
[0023]
在本发明的一些实施例中，所述抗体结合分子模块含有：聚合度为1-6的聚乙二醇peg链接臂、1-3个甘氨酸、至少1个结合分子。
[0024]
在本发明的一些实施例中，所述抗体结合分子模块含有：聚合度为1或3或6的聚乙二醇peg链接臂、3个甘氨酸、1个抗体结合分子。
[0025]
其中，抗体结合分子如鼠李糖，作为抗体结合分子模块的核心组分，通过招募体内体引发免疫效应作用，起到肿瘤杀伤功能。聚乙二醇分子为鼠李糖分子的连接臂。此外，连接臂另一侧含有3个连续的甘氨酸，用于转肽酶a识别进行连接反应。
[0026]
在本发明的一些实施例中，所述聚乙二醇peg连接臂的聚合度为1或3或6。
[0027]
在本发明的一些实施例中，本发明的偶联物为一种靶向肿瘤糖类抗原的抗体结合分子，该分子由以下两个部分偶联形成：
[0028]
a、重组志贺毒素b亚基重组蛋白；
[0029]
b、鼠李糖分子模块；
[0030]
其中，所述志贺毒素b亚基重组蛋白由志贺毒素b亚基蛋白经羧基端修饰获得，所述羧基端修饰为：在所述志贺毒素b亚基蛋白的羧基端修饰myc标签、转肽酶a识别位点、his标签序列；
[0031]
所述鼠李糖分子模块含有：聚合度为1-6的聚乙二醇peg链接臂、1-3个甘氨酸、至少一个鼠李糖分子。
[0032]
在本发明的一些实施例中，所述鼠李糖分子模块含有：聚合度为1-6的聚乙二醇peg链接臂、3个甘氨酸、一个鼠李糖分子。
[0033]
在本发明的一些实施例中，所述抗体结合分子模块的制备方法包括以下步骤：
[0034]
s1、结合分子乙酰化后，在三氟化硼醚合物催化下，与带有叠氮基保护的聚乙二醇分子偶联，得化合物a；
[0035]
s2、在zempl
é
n酯交换条件下，化合物a除去乙酰基，得到1号位带有叠氮链的化合物b；
[0036]
s3、化合物b在加氢条件下还原得到化合物c；
[0037]
s4、通过二环己基碳二亚胺和nhs方法活化boc保护三甘氨酸化合物的羧基，形成活性酯，再与化合物c通过酰胺缩合反应形成化合物d；
[0038]
s5、化合物d通过三氟乙酸脱除去boc保护基团，乙醚沉淀得到三甘氨酸修饰的抗体结合分子聚合物。
[0039]
在本发明的一些实施例中，所述体外酶法融合修饰的方法为，以包含tris、nacl、cacl2的ph7.5pbs缓冲液为酶反应体系，在所述酶反应体系中加入志贺毒素b亚基重组蛋白、抗体结合分子模块如鼠李糖分子模块及转肽酶a，于4-25℃振荡反应1-5h，获得所述志贺毒素b亚基的多聚半抗原抗体募集分子。
[0040]
在本发明的一些实施例中，所述酶反应体系中包含50mm tris、150mm nacl、5mm cacl2的ph6.0-8.0pbs缓冲液；所述志贺毒素b亚基重组蛋白的浓度为1-50μm，所述抗体结合分子模块(如半抗原模块)的浓度为100-400μm，所述转肽酶a的浓度为1-5μm。
[0041]
本发明的第二个目的是，提供一种上述的偶联物的制备方法，包括以下步骤：
[0042]
1)志贺毒素b亚基重组蛋白的原核表达和纯化；
[0043]
2)抗体结合分子模块的形成：在结合分子的一侧依次连接peg链接臂、甘氨酸；
[0044]
3)志贺毒素b亚基重组蛋白与所述抗体结合分子模块通过体外酶法融合修饰，得到所述偶联物。
[0045]
在本发明的一些实施例中，本发明提供一种用于志贺毒素b亚基与鼠李糖半抗原模块偶联的抗体招募分子的制备方法，包括以下步骤：
[0046]
1)志贺毒素b亚基重组蛋白的原核表达和纯化；
[0047]
2)鼠李糖分子的合成：通过相应的化学合成得到；
[0048]
3)志贺毒素b亚基重组蛋白与鼠李糖分子的体外酶法融合修饰，得到所述的志贺毒素b亚基与鼠李糖半抗原模块偶联的抗体招募分子。
[0049]
本发明是一种由志贺毒素b亚基与半抗原/完全抗原或其衍生物(如鼠李糖半抗原)或含有半抗原/完全抗原或其衍生物的载体(如多肽载体)偶联形成的抗体募集分子，以鼠李糖半抗原为例，首先外源表达志贺毒素b亚基重组蛋白，然后将志贺毒素b亚基重组蛋白与化学合成的鼠李糖分子模块进行体外酶法融合修饰，得到所述的志贺毒素b亚基与鼠李糖的偶联物，其他抗原同理。
[0050]
在本发明的一些实施例中，所述的原核表达即外源表达，包括在原核大肠杆菌e.coli bl21(de3)中。
[0051]
本发明的第三个目的是，提供一种组合物，该组合物包括上述的偶联物。组合物的形式可以是药剂、营养品等任意一种。
[0052]
本发明的第四个目的是，提供一种上述的偶联物或组合物的应用，所述偶联物或组合物应用于靶向肿瘤糖类抗原，所述肿瘤糖类抗原包括gb3糖类抗原、gb4糖类抗原及gd2、gd3、gm2、gm3、globo-h、tn、stn、tf、slea、slex、ley等糖类抗原，所述应用包括体外抗肿瘤应用及体内抗肿瘤应用。
[0053]
本发明主要是用于志贺毒素b亚基与包括鼠李糖半抗原在内的半抗原这类具有体内抗体结合功能的分子进行偶联的抗体招募分子的体外抗肿瘤应用，所述体外抗肿瘤应用包括对肿瘤细胞包括ht-29，k562等的靶向识别，对肿瘤细胞包括ht-29，k562的免疫杀伤。肿瘤包括但不限于结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺等。
[0054]
本发明的另一目的在于，提供一种用于志贺毒素b亚基与包括鼠李糖在内的结合分子偶联的抗体招募分子的体内抗肿瘤应用，所述的体内抗肿瘤应用包括对体内肿瘤的生长抑制。
[0055]
有益效果：本发明提供的志贺毒素b亚基与鼠李糖等半抗原模块的偶联物、制备方法、应用，与现有技术相比，具有以下优势：本发明利用了志贺毒素b亚基的天然五聚体结构和gb3靶向结合特征，构建的抗体募集分子含有多个如鼠李糖这类半抗原/完全抗原的结合分子，能够高效地靶向肿瘤细胞并发挥了基于抗体免疫功能的高效肿瘤细胞杀伤能力，能够有效地抑制肿瘤的生长。该制备方法具有成本低、方法简便、实验周期短、抗肿瘤活性好等优点。
附图说明
[0056]
图1为本发明的技术路线示意图。
[0057]
图2为志贺毒素1b、2b重组蛋白的结构组成示意图。
[0058]
图3为纯化后志贺毒素1b、2b重组蛋白的sds-page电泳表征图。
[0059]
图4为鼠李糖小分子模块17、18、19的合成路线。
[0060]
图5为纯化后鼠李糖小分子模块17的质谱表征关键数据。
[0061]
图6为纯化后鼠李糖小分子模块18的质谱表征关键数据。
[0062]
图7为纯化后鼠李糖小分子模块19的质谱表征关键数据。
[0063]
图8为纯化后偶联物经sds-page表征的关键数据。
[0064]
图9为纯化后偶联物经western-blot表征的关键数据。
[0065]
图10为偶联物靶向结合肿瘤细胞特异性表征的关键数据。
[0066]
图11为偶联物招募鼠李糖抗体的表征关键数据。
[0067]
图12为志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物对ht-29肿瘤细胞的cdc细胞毒性的关键数据。
[0068]
图13为志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物对ht-29肿瘤细胞的adcc细胞毒性的关键数据。
[0069]
图14为志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物1b-3r体内抗肿瘤活性的关键数据。
具体实施方式
[0070]
本发明属于生物化学及抗肿瘤研究领域，具体涉及一种基于志贺毒素b亚基重组蛋白抗体募集分子、制备方法，如图1所示，制备本发明的抗体募集分子包括步骤：
[0071]
a、志贺毒素b亚基重组蛋白的原核表达和纯化；
[0072]
b、含有甘氨酸的抗体结合分子模块的合成；
[0073]
c、上述重组蛋白与抗体结合分子模块的体外酶法融合修饰。
[0074]
本发明所述的偶联物，能够有效地靶向识别肿瘤gb3、gb4、gd2、gd3、gm2、gm3、globo-h、tn、stn、tf、slea、slex、ley等糖类抗原，并募集体内鼠李糖抗体杀伤肿瘤细胞，具有高效的体内肿瘤抑制作用，可以应用于包括结直肠在内的多种包括上述的gb3、gb4等这类抗原阳性肿瘤的免疫治疗。所述的偶联物分子相比其他类似分子，制备成本低、制备方法简单、靶向专一性强、肿瘤抑制活性强。
[0075]
下面结合附图和实施例，以鼠李糖作为半抗原的代表，对本发明作更进一步的说明。但应当理解这些实施例并非限制本发明的范围，与鼠李糖抗体募集功能类似的2，4二硝基苯、α-1，3-半乳糖等半抗原，类似性质的完全抗原，以及这些半抗原、完全抗原的衍生物，这一类抗原，以及含有上述抗原的载体，因其具有相同的原理和效果，同样属于本发明的保护范围。
[0076]
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0077]
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0078]
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0079]
实施例1志贺毒素1b和2b亚基重组蛋白序列的设计
[0080]
查找志贺毒素stx1b，stx2b亚基蛋白质序列(seq 1，seq 4)，对其羧基端进行修饰。所述的修饰包括，在志贺毒素stx1b，stx2b亚基蛋白质的序列羧基末端依次加入myc标签(eqkliseedlngaa)、转肽酶a识别位点lpetgg(l：亮氨酸；p：脯氨酸；e：谷氨酸；t：苏氨酸；g：甘氨酸)、组氨酸纯化标签hhhhhh(h：组氨酸)，将该重组蛋白命名为1b，2b，其氨基酸序列
如seq id 2，seq id 5所示。
[0081]
将上述蛋白质氨基酸序列进行密码子优化，获得1b和2b蛋白的基因序列，其核酸序列如seq id 3和seq id 6所示。将优化后的基因序列分别插入pet22b质粒中，得到表达质粒载体pet22b-1b和pet22b-2b。将上述表达质粒分别转入大肠杆菌e.coli bl21(de3)得到相应的表达菌株e.coli bl21(de3)-1b和e.coli bl21(de3)-2b。
[0082]
图2为志贺毒素1b、2b重组蛋白的结构组成示意图。上述示意图所示，志贺毒素1b和2b重组蛋白分别均含有myc、转肽酶a识别位点、组氨酸纯化标签。
[0083]
实施例2志贺毒素1b和2b亚基重组蛋白的表达与纯化
[0084]
将20μl表达菌株e.coli bl21(de3)-1b和e.coli bl21(de3)-2b分别接种至3ml氨苄抗性的lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l)中，37℃，200rpm过夜培养。第二天按照4％的接种量转接至tb发酵培养基(蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，甘油4g/l，kh2po
4 23.1g/l，k2hpo
4 125.4g/l)，待培养液浓度od
600
达到0.6-1.2之后，加入终浓度为0.4mm的诱导剂iptg进行诱导，蛋白表达的条件为20℃，200rpm，发酵时间为24h。
[0085]
发酵完毕后，9000rpm离心5min收集菌体，弃置上清。菌体用破壁缓冲液(10mm tris，500mm nacl，ph8.0)重悬后，用超声破碎仪进行破碎，破碎条件为：冰浴，运行2s，停3s，运行时长20min。破碎完毕后，9000rpm离心10min，重复三次，以彻底除去细胞碎片，得到澄清的裂解液。将该裂解液在4℃环境下与镍离子亲和层析柱孵育0.5h，然后用含25mm咪洗涤层析柱以去除杂蛋白。最后用含25mm-500mm咪唑的梯度洗脱缓冲液将重组蛋白1b和2b洗脱。纯化后的蛋白经脱盐后冻干，置于-20℃备用。
[0086]
图3为纯化后志贺毒素1b、2b重组蛋白的sds-page电泳表征图。1：1b蛋白流穿液，2：50mm咪唑洗脱1b，3：100mm咪唑洗脱1b，4：250mm咪唑洗脱1b，5：350mm咪唑洗脱1b，6：500mm咪唑洗脱1b，7：2b蛋白流穿液，8：50mm咪唑洗脱2b，9：100mm咪唑洗脱2b，10：250mm咪唑洗脱2b，11：350mm咪唑洗脱2b，12：500mm咪唑洗脱2b，m：标准蛋白分子。经image j软件灰度分析表明，两者纯度均达到90％以上。
[0087]
实施例3鼠李糖小分子模块的合成
[0088]
如图4所示，鼠李糖小分子模块的合成步骤如下：
[0089]
s1、以鼠李糖小分子(1g)为原材料1，完全乙酰化后制备得到鼠李糖中间物2、3、4。然后在三氟化硼醚合物催化下，将鼠李糖中间物2、3、4分别与带有叠氮基保护的聚乙二醇(聚合度为1、3、6)分子(400mg)偶联得到化合物a即产物5、6、7，产率分别为75％，65％和58％。
[0090]
s2、随后在zempl
é
n酯交换条件下，除去化合物a即5、6、7中的乙酰基，得到1号位带有叠氮链的化合物b即8、9、10，产率分别为90％，85％和84％。
[0091]
s3、在加氢条件下还原化合物b即8、9、10得到化合物c即11、12、13，产率分别为98％，95％和94％。
[0092]
s4、通过二环己基碳二亚胺和nhs方法活化boc保护三甘氨酸化合物的羧基，形成活性酯，然后分别与化合物c即11、12、13反应，通过酰胺缩合反应形成化合物d即产物14、15、16，产率分别为56％，54％和45％。
[0093]
s5、最后，化合物d通过三氟乙酸脱除去boc保护基团，再用乙醚沉淀法得到三甘氨酸修饰的鼠李糖小分子模块17、18、19。
[0094]
图4为鼠李糖小分子模块17、18、19的合成路线。反应条件为a：pyridine(20ml)，ac2o(18ml)；b：bf
3-et2o(1ml)，dcm(10m1)；c：naome(10μl)，meoh(5ml)；d：pd/c(25mg)，h2，meoh(5ml)；e：dipea(0.5ml)，dmf(5ml)；f：tfa∶dcm＝1∶1，95％。
[0095]
图5、6、7为纯化后鼠李糖小分子模块17、18、19的质谱表征关键数据。上述数据显示，所制备的鼠李糖分子量17、18、19符合预期。
[0096]
实施例4志贺毒素1b亚基和2b重组蛋白与鼠李糖偶联物的酶法制备
[0097]
所采用的酶反应体系为：1ml含50mm tris，150mm nacl，5mm cacl2反应缓冲液，ph7.5，1b或2b亚基重组蛋白浓度为20μm，不同链长的鼠李糖小分子模块的浓度均为250μm，转肽酶a终浓度为5μm。反应条件为：16℃，摇床200rpm，2h。反应完成后，利用镍离子亲和层析柱纯化，既可以去除未反应的重组蛋白和转肽酶a，收集含有偶联物的流穿液。采用3kda的超滤管对上述流穿液进行脱盐，然后冻干，置于-20℃备用，偶联物分别命名为1b-1r，1b-3r，1b-6r；2b-1r，2b-3r，2b-6r。
[0098]
图8为纯化后偶联物经sds-page表征的关键数据。上述数据显示，合成后的偶联物相对于对照stx1b和stx1b的分子量有显著减少，符合预期。所有偶联物的纯度达到90％以上。
[0099]
图9为纯化后偶联物经western-blot表征的关键数据。上述数据显示，所有纯化后的偶联物均可以被鼠李糖抗体(anti-rha)标记检测，而不能够被his标签抗体(anti-his)标记检测。对照stx1b和stx1b重组蛋白呈现与偶联物相反的结果。所有蛋白均可以被myc标签抗体(anti-myc)标记检测。上述数据证明，1b和2b分别与鼠李糖小分子模块成功偶联。
[0100]
实施例5志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物的肿瘤细胞靶向特异性
[0101]
使用胰蛋白酶消化并收集培养瓶中的ht29肿瘤细胞，将细胞浓度稀释至5
×
104个/管。每管加入含stxb或偶联物浓度为500nm的2％bsa-pbs溶液100μl，混合均匀后在常温下孵育30min。对照组中加入等量的2％bsa-pbs溶液。孵育结束后，向各管中加入500μl pbs缓冲液重悬细胞，在1000
·
min-1，4℃的条件下离心5min，去除上清液，重复2次。各管中加入100μl浓度为20μg
·
ml-1的兔源myc标签抗体，混合均匀后在常温下孵育30min。孵育结束后，向ep管中加入500μl pbs缓冲液重悬，在1000
·
min-1，4℃的条件下离心5min后去除上清液，重复2次。各管中加入alexa 647荧光标记的山羊抗兔抗体二抗100μl(20μg
·
ml-1)。混合均匀后在常温下孵育30min，孵育结束后，向ep管中加入500μl pbs缓冲液重悬，在1000
·
min-1，4℃的条件下离心5min后去除上清液，重复2次。最后，各管中加入2％bsa流式液200μl，并重悬细胞。使用流式细胞仪分析样品，flowjo软件处理结果。
[0102]
图10为偶联物靶向结合肿瘤细胞特异性表征的关键数据。图a为流式细胞术直方图。图b为平均荧光强度(mfi)的直方图。上述数据显示，相对于1b和2b蛋白对照，所有的偶联物对肿瘤细胞的结合能力有一定的下降，但仍保留了50％以上的亲和力，均可以通过gb3糖类抗原特异性的结合ht29细胞。
[0103]
实施例6志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物的抗体招募活性
[0104]
使用胰蛋白酶消化并收集培养瓶中的ht29肿瘤细胞，将细胞浓度稀释至5
×
104个/管。每管加入偶联物浓度为500nm的bsa-pbs溶液100μl，混合均匀后在常温下孵育30min。对照组中加入等量的2％bsa-pbs溶液。孵育结束后，向各管中加入500μl pbs缓冲液重悬细胞，在1000
·
min-1
，4℃的条件下离心5min，去除上清液，重复2次。各管中加入100μl
体积浓度为1％的含有鼠李糖抗体的小鼠血清，混合均匀后在常温下孵育30min。孵育结束后，向ep管中加入500μl pbs缓冲液重悬，在1000
·
min-1
，4℃的条件下离心5min后去除上清液，重复2次。各管中加入alexa 647荧光标记的山羊抗兔抗体二抗100μl(20μg
·
ml-1
)。混合均匀后在常温下孵育30min，孵育结束后，向ep管中加入500μl pbs缓冲液重悬，在1000
·
min-1
，4℃的条件下离心5min后去除上清液，重复2次。最后，各管中加入2％bsa流式液200μl，并重悬细胞。使用流式细胞仪分析样品，flowjo软件处理结果。
[0105]
图11为偶联物招募鼠李糖抗体的表征关键数据。图a为流式细胞术直方图。图b为平均荧光强度(mfi)的直方图。上述数据显示，所有的偶联物均可以结合ht29细胞，并有效募集鼠李糖抗体至ht29肿瘤细胞。其中，偶联物1b-6r的抗体募集能力最强。
[0106]
实施例7志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物的体外抗肿瘤活性
[0107]
将ht-29肿瘤细胞按104个细胞/孔接种到96孔板中，在37℃下过夜培养。空白孔则加入等量完全培养基。去除96孔板中的培养基，实验组每孔加入100μl含500nm偶联物的培养基，stxb实验组每孔加入100μl含500nm stxb重组蛋白的培养基。孵育30min后，每孔加入100μl的1％抗鼠李糖小鼠血清及2％的兔补体pbs缓冲液。空白对照组则加入只含有1％抗rha小鼠血清及2％的兔补体的pbs缓冲液。放入37℃下培养4h。使用cck8细胞毒性试剂盒，按照说明书方法，在450nm处测量细胞活力。使用以下等式计算cdc细胞毒性：cdc细胞毒性＝(1-(a
x-a
max
)/(a
0-a
max
))
×
100。其中a
x
为实验组吸光值，a0为空白对照组吸光值，a
max
代表最大释放孔吸光度值(加入1％triton x-100处理细胞)。计算所得比例为偶联物通过cdc效应杀伤肿瘤细胞的活性。
[0108]
将ht-29肿瘤细胞按104个细胞/孔接种到96孔板中，在37℃下过夜培养。空白孔则加入等量完全培养基。参考淋巴细胞分离液说明书，从新鲜人血液中分离pbmc细胞作为效应细胞，并用adcc缓冲液重悬至1
×
106/ml备用。实验组中每孔加入含500nm偶联物的培养基100μl，1b或2b实验组中每孔加入含500nm的1b或2b重组蛋白的培养基100μ。同时加入1％的抗鼠李糖的小鼠血清，在37℃下孵育30min。孵育结束后用pbs洗涤2次，随后在所有实验组孔中加入200μl效应细胞(2
×
105个)。在不含ht29细胞的孔中加入单独的pmmc细胞作为自然释放孔，37℃处理4h。采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，按照说明书方法，在490nm下测定吸光值。采用以下公式计算adcc细胞毒性：
[0109]
adcc细胞毒性＝((a
x-a0)/a
max
)
×
100
[0110]
其中a
x
为实验组吸光值，a0为pbmc细报自发释放孔吸光值，a
max
代表最大释放孔吸光度值(按照试剂盒说明书加入ldh释放剂处理细胞)。计算所得比例为偶联物通过adcc效应杀伤肿瘤细胞的活性。
[0111]
图12为志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物对ht-29肿瘤细胞的cdc细胞毒性的关键数据。结果表明，所有的偶联物均对ht-29肿瘤细胞具备杀伤活性。其中，偶联物1b-3r的细胞杀伤率为67％，偶联物2b-3r的细胞杀伤率为78％。志贺毒素1b和2b对肿瘤细胞的本底杀伤率分别14％和34％，因此志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物具有通过cdc增强的肿瘤细胞杀伤能力，具备体外抗肿瘤活性。
[0112]
图13为志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物对ht-29肿瘤细胞的adcc细胞毒性的关键数据。结果表明，所有的偶联物均对ht-29肿瘤细胞具备杀伤活性。其中，偶联物1b-1r、1b-3r、1b-6r的细胞杀伤率无差别，均为40％。偶联物2b-3r的细胞杀伤率为46％。志贺毒素1b
和2b对肿瘤细胞的本底杀伤率分别10％和24％，因此志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物具有通过adcc增强肿瘤细胞杀伤的能力，具备体外抗肿瘤活性。
[0113]
实施例8志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物的体内抗肿瘤活性
[0114]
优选的，在本实施例中，以志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物1b-3r为例进行体内抗肿瘤活性的验证。将3
×
106个ht29结直肠细胞皮下注射于balb/c裸鼠(雌性，4-6周龄)的左侧腹，约6天后ht29细胞在小鼠体内形成肿瘤，成功构建小鼠移植瘤模型。将肿瘤体积介于40-70mm3的小鼠随机均分为3组进行治疗。第1组，pbs对照组，每次注射50μl pbs和50μl抗鼠李糖小鼠血清；第2组，志贺毒素1b对照组，每次注射50μl重组蛋白1b(40ug)和50μl抗鼠李糖小鼠血清；第3组，志贺毒素1b与鼠李糖偶联物1b-3r的治疗组，每次注射50μl的偶联物1b-3r(40ug)和50μl抗rha小鼠血清。给药方式为采用尾静脉给药，每天一次，持续一周。每日监测小鼠的肿瘤体积，通过游标卡尺测量肿瘤的长和宽，并通过公式：1/2
×
(长度
×
宽度2)计算每个肿瘤体积。小鼠治疗12天后，安乐死小鼠，解剖收集肿瘤组织，对各组小鼠肿瘤组织进行拍照，测定最终的体积和重量。计算每组小鼠的平均肿瘤体积、平均肿瘤质量，计算肿瘤抑制率。
[0115]
图14为志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物1b-3r体内抗肿瘤活性的关键数据。如图a所示，pbs对照组小鼠肿瘤快速持续增长，实验组偶联物1b-3r能够显著抑制肿瘤的生长，而对照1b无显著的肿瘤抑制作用。如图b所示，pbs对照组小鼠肿瘤体积普遍较大，1b对照组无显著的肿瘤抑制作用，实验组偶联物1b-3r中肿瘤显著减小。图c为肿瘤质量平均数据，与pbs对照组相比1b实验组无肿瘤抑制作用，1b-3r偶联物实验组肿瘤体积显著减小。图d为根据最终肿瘤质量计算的抑瘤率数据，1b蛋白无显著抑瘤效果，而偶联物1b-3r的抑瘤率达到49.1％
[0116]
实施例9鼠李糖半抗原的多肽载体的合成
[0117]
半抗原选用含鼠李糖半抗原的多肽载体gggsgggsgggs-rhamnose，该物质是含有鼠李糖半抗原的载体，采用与实施例3类似的方法制备含鼠李糖半抗原的多肽载体，并采用实施例4所述的方法与志贺毒素1b亚基和2b重组蛋白酶法偶联，获得的偶联物具有与实施例4相近的纯度，表明志贺毒素b亚基与含鼠李糖半抗原的多肽载体的偶联物成功制备。而且，采用与实施例5-8相同的测试方法对制备得到的偶联物进行测试，获得了相近的技术效果，说明含鼠李糖半抗原的多肽载体适用于本发明。
[0118]
同理，其他同性质的含有鼠李糖或其衍生物的载体如含鼠李糖半抗原的脂质体载体、鼠李糖半抗原的多糖聚合物载体、含鼠李糖半抗原的脂质聚合物载体、含鼠李糖半抗原的蛋白载体等，以及包含其他半抗原如2，4二硝基苯，α-1，3-半乳糖半抗原等的该类载体，也具有同等功效，本发明在此不做赘述。
[0119]
实施例10 2，4二硝基苯半抗原模块的合成
[0120]
半抗原选用2，4二硝基苯，2，4二硝基苯小分子模块的制备方法如下：
[0121]
首先，以2，4二硝基苯胺(3g)为原材料，在酰氯化试剂pocl3(1.8g)和催化剂pyridine(1ml)条件下，与两端分别含有羧基和boc保护的氨基的聚乙二醇(聚合度为1、3、6)分子(2g)酰胺缩合得到中间产物a1(聚合度为1、3、6)。
[0122]
随后，在三氟乙酸的条件下，除去化合物a1中的boc保护基团，得中间产物b。
[0123]
然后，通过二环己基碳二亚胺和nhs方法活化boc保护三甘氨酸化合物的羧基，形
成活性酯，然后将其与化合物b反应，通过酰胺缩合反应形成化合物c。
[0124]
最后，化合物c通过三氟乙酸脱除去boc保护基团，再用乙醚沉淀法得到三甘氨酸修饰的2，4二硝基苯小分子模块。所得的2，4二硝基苯小分子模块的产率为83％，纯度为96％，与实施例3相近。
[0125]
所得的2，4二硝基苯小分子模块采用实施例4所述的方法与志贺毒素1b亚基和2b重组蛋白酶法偶联，获得的偶联物具有与实施例4相近的纯度，表明志贺毒素b亚基与2，4二硝基苯偶联物成功制备。而且，采用与实施例5-8相同的测试方法对制备得到的偶联物进行测试，获得了相近的技术效果，说明2，4二硝基苯半抗原适用于本发明。
[0126]
同理，其他同性质的半抗原如α-1，3-半乳糖半抗原等，也具有同等功效，本发明在此不做赘述。
[0127]
实施例11 ha完全抗原模块的合成
[0128]
完全抗原选用人流感病毒血凝素ha抗原肽ypydvpdya，ha完全抗原抗体结合分子模块的制备方法如下：基于fmoc保护合成策略，以氨基树脂作为固相载体，采用多肽固相合成仪制备gggsgggsgggsypydvpdya多肽，获得的ha完全抗原抗体结合分子模块的产率为78％和纯度为95％。
[0129]
所得的ha小分子模块采用实施例4所述的方法与志贺毒素1b亚基和2b重组蛋白酶法偶联，获得的偶联物纯度为90％，表明志贺毒素b亚基与ha小分子模块偶联物成功制备。而且，采用与实施例5-8相同的测试方法对制备得到的偶联物进行测试，获得了相近的技术效果，说明ha完全抗原适用于本发明。
[0130]
同理，其他同性质的完全抗原如肺炎球菌、流脑球菌的多糖完全抗原等，以及其衍生物，还有包含这些完全抗原或其衍生物的载体，如含所述抗原的脂质体载体、多糖载体等也具有同等功效，本发明在此不做赘述。
[0131]
实施例12志贺毒素b亚基与鼠李糖偶联物的gb4、gb2阳性肿瘤细胞靶向特异性
[0132]
采用实施例5的方法，区别在于将gb3糖类抗原特异性表达的ht29细胞换做gb4/gb2糖类抗原特异性表达的hat-7细胞，对实施例4所得的偶联物进行gb4/gb2糖类抗原特异性实验。本实施例获得了与实施例5相近的技术效果，说明本发明所制得的偶联物对gb4、gb2糖类抗原具有同样的靶向特异性。
[0133]
同理，本发明所制得的偶联物对其他同性质的靶向抗原如gd2、gd3、gm2、gm3、globo-h、tn、stn、tf、slea、slex、ley等，也具有同等的靶向特异性，本发明在此不做赘述。
[0134]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。