铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA的适配体PilA-2及用途

本发明属于医学微生物和分子生物学，涉及铜绿假单胞菌iv型菌毛蛋白pila的适配体pila-2及用途。

背景技术：

1、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)，又名绿脓杆菌，可产生绿脓素和荧光素，在培养基上呈蓝绿色荧光，感染伤口时形成绿色脓液。铜绿假单胞菌为重要的条件致病菌，是医院常见病原体之一，引起一些列严重的化脓性感染。它存在于在人的肠道、皮肤、呼吸道等，当人的免疫力低下或者防御机制遭受破坏，以及治疗操作或手术后的患者等易导致铜绿假单胞菌的感染，且居非发酵细菌感染首位。随着抗菌药物的广泛应用，铜绿假单胞菌的耐药性越来越严重，并逐年增加趋势，给临床治疗带来了极大困难，导致高致死率。目前国内外对铜绿假单胞菌的耐药机理进行深入的研究。研究表明，铜绿假单胞菌的耐药机制异常复杂，其中在体内极易形成菌膜的成为其耐药的主要原因之一。铜绿假单胞菌菌膜浮游细菌吸附到固体表面，接着形成小菌落，三级结构的发育和整个群落被菌表多糖包被。铜绿假单胞菌菌膜是浮游细菌附着在物体表面形成的被多聚基质包裹着细菌，成为具有屏障功能的细菌结构群体，从而逃避机体的免疫应答和抗菌药物的杀灭作用，并且在细胞形态和生理上会发生很大的变化，因此抑制生物膜的形成具有重要的意义。

2、铜绿假单胞菌拥有极性细丝的iv型菌毛，通过它的抽搐运动参与附着于物体和宿主组织表面。菌毛伸展和收缩介导的抽搐运动是铜绿假单胞菌生物膜形成所必需的。pila是iv型菌毛中上段蛋白，由pila的数千个亚单位组成，通过复杂的组装机快速聚合和解聚。它和小pilins具有相似的棒棒糖样拓扑结构，具有高度保守的疏水n-端α-螺旋，与可变c-端反平行β-折叠。成熟菌毛蛋白的第1个，24个残基将亚单位固定在内膜上，直到它们被组装机器聚合。在浮游细菌的抽搐运动和粘附占有重要作用，因此pila是菌膜形成的关键蛋白之一。有研究表明，iv型菌毛中段上的pila蛋白在细菌耐药性中起到了关键作用。研究pila蛋白的存在形式以及结构有助于深入研究铜绿假单胞菌的生物膜耐药机制，为细菌耐药机制及干预提供依据。因此通过改变iv型菌毛蛋白pila的结构是抑制铜绿假单胞菌的菌膜的形成的有效途径。

3、目前，适配体的研究是一个研究热点。它是能够与许多靶标分子(药物，蛋白，无机或有机分子)发生高特异性和高亲合性结合的一类单链核酸(dnaorrna)。采用配体指数富集系统(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)筛选高特异性和高亲和性的适配体。由于适配体结构稳定，且易修饰基团，在医学研究上常被用于靶向治疗和检测等方面。继2004年针对血管内皮生长因子(vegf)的适配体—macugen，被批准用于治疗年龄相关的黄斑变性(amd)以后，另外两种用于眼睛相关疾病治疗的适配体药物—zimura和fovista也分别进入二期和三期临床试验(huangyf,shangguandh,liuhp,phillipsja,zhangxl,cheny,tanwh.molecularassemblyofan aptamer-drugconjugatefortargeteddrugdeliverytotumorcells.chembiochem2009,10(5):862-868.)。还有一些适配体正处于临床试验的不同阶段，各种医学实验正在进行测试。但迄今尚无针对铜绿假单胞菌iv型菌毛蛋白pila的适配体报道或公开，因此本发明拟考虑核酸适配体应用于改变pila蛋白结构来有效抑制菌毛的抽搐运动及粘附性能(原理如图1所示)。开发针对iv型菌毛蛋白pila的核酸适配体，将为抑制铜绿假单胞菌菌膜的形成，为干预其多重耐药提供有力支持，并为铜绿假单胞菌的靶向治疗和检测奠定基础，具有重要的临床价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供以铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila为靶标的核酸适配体pila-2序列。

2、本发明的进一步目的是提供所述核酸适配体序列的用途，可以作为一种抑制铜绿假单胞菌菌膜形成的核酸药物，也根据核酸序列设计铜绿假单胞菌靶向治疗方案。

3、本发明之铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila核酸适配体pila-2序列制备的方案是：

4、铜绿假单胞菌iv型菌毛蛋白pila的适配体，适配体是以铜绿假单胞菌iv型菌毛中上段蛋白pila为靶标的核酸适配体序列，其核酸序列为：pila-2：5’-cgtcacacagcttaccccccgaacatctcggttgc-3’。

5、作为优选，所述铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila核酸适配体pila-2在铜绿假单胞菌感染的靶向治疗中的应用。

6、作为优选，所述铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila核酸适配体pila-2在抑制铜绿假单胞菌的菌膜中的应用。

7、作为优选，所述铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila核酸适配体pila-2在制备药物或其他制品中的用途。

8、作为优选，所述药物为菌膜抑制药物或抑制剂。

9、作为优选，所述铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila核酸适配体pila-2在制备检测铜绿假单胞菌的探针中的用途。

10、作为优选，所述铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila核酸适配体pila-2在制备检测铜绿假单胞菌的药物靶点中的用途。

11、先从上海生工购买基因表达纯化蛋白pila.随后利用适配体的selex体外筛选技术，以收集纯化后的pila蛋白为靶标，从78个碱基的随机ssdna文库(5'-gggagctcagaataaacgctcaa-n35-ttcgacatgaggcccggatc-3')中筛选出与pila蛋白特异结合的核酸适配体，将筛选出来的序列用上游引物p1(5'-gggagctcagaataaacgctcaa-3')和磷酸标记的下游引物p2(5'-po4-gatccgggcctcatgtcgaa-3')进行扩增。然后再酶切成ssdna成下来一轮文库，筛选12轮后送至上海生工进行高通量测测序。其中pila-2序列重复率达到23.34％，表明序列在测序样本中重复出现次数高，是在12轮筛选中保留下来的优势序列。

12、pila-2：cgtcacacagcttaccccccgaacatctcggttgc。

13、然后合成适配体序列，对其亲和力进行分析，并且考察不同浓度适配体(0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μm)对菌膜抑制作用。

14、本发明中，所述的核酸序列构成的适配体可与铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila特异性结合，可用于抑制铜绿假单胞菌的菌膜及靶向治疗。所述的核酸序列构成的适配体也可以作为检测pila蛋白的探针或靶点。

15、与目前相关技术对比，本发明具有如下良好的效果：

16、1、本发明获得以铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila为靶标的核酸适配体序列pila-2，其核酸序列分别为：5’-cgtcacacagcttaccccccgaacatctcggttgc-3’。

17、2、本发明铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila核酸适配体pila-2序列在制备药物或其它制品中的作用巨大。

18、3、本发明含有铜绿假单胞菌ⅳ菌毛蛋白pila核酸适配体pila-2序列的药物为菌膜抑制剂和铜绿假单胞菌的靶向治疗提供有力支持，其将具有重要的临床价值。