一种检测脊髓性肌萎缩症致病基因SMN1的引物探针组以及试剂盒的制作方法

本发明属于生物，涉及一种检测脊髓性肌萎缩症致病基因smn1的引物探针组以及试剂盒。

背景技术：

1、脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)是一种儿童最常见的神经肌肉病，临床特征以脊髓前角α-运动神经元退化变性导致的肌无力和肌萎缩为主。sma患者临床症状差异大，从出生后至成人期均可发病。主要表现为以四肢近端为主的进行性肌无力和肌萎缩，随着疾病进展，可出现呼吸、消化、骨骼等多系统受累。

2、sma属于常染色体隐性遗传性疾病，由运动神经元生存基因1(survival motorneuron 1，smn1)突变引起，smn1突变导致脊髓前角细胞的α运动神经元退化，进而导致严重的进行性肌张力减退和肌肉无力，从而可引起患者早期死亡。smn基因有两个高度同源的smn1和smn2基因，目前发现smn1和smn2基因只有在外显子6到外显子8区域存在5个碱基的区别(c.835-44，c.840，ins7+100，ins7+215，c.*239)，c.840在7号外显子上，同源性大于99％，均编码smn蛋白。smn1基因编码有功能的全长smn蛋白，smn2仅表达少量的有正常功能的蛋白。smn1为sma的致病基因，smn2作为修饰代偿基因与疾病严重程度相关。

3、sma突变基因型主要有两类，95％由smn1基因双等位纯合缺失所致；5％由smn1基因复合杂合突变所致，即一个等位基因缺失，另一个等位基因发生微小致病性变异(包括点突变)。smn1双等位基因均为微小致病性变异的情况则非常罕见。smn1基因缺失大部分为外显子7合并外显子8共同缺失，少部分仅为外显子7缺失。smn1基因微小致病性变异在不同种族患者中表现出不同的变异谱系，目前国内外已报道的微小致病性变异约90种(http://www.hgmd.cf.ac.uk/)，中国患者已报道近30种，其中检测频次≥2并经美国医学遗传与基因组学学会(acmg)致病性评估确认的致病性微小变异有7种。在中国人群中最常见的变异为第1外显子的c.22dupa(p.ser8lys fs*23)以及第5外显子的c.683t>a(p.leu228*)，分别约占全部点突变的31.7％和17.1％。

4、sma的人群携带频率约为1/40-50，估计发病率为1/10000-12000活产儿，是常见的常染色体隐性遗传病。sma的高致残性、高致死性，给患者家庭和社会带来沉重的影响与负担。目前疾病修正治疗及基因治疗药物的相继上市，给患者带来了很大的希望。越来越多的证据表明对患儿进行症状前基因治疗越早，患者获益最大，大多数患者甚至可表现为运功功能发育正常。通过新生儿筛查进行早期检测对于确保在出现疾病症状之前获得有效治疗至关重要。通过携带者筛查确定的产前病例也将允许早期治疗。sma的携带者和新生儿筛查在一些国家和地区已常规开展，sma预防窗口进一步提前。

5、2020年《脊髓性肌萎缩症遗传学诊断专家共识》(以下简称《遗传学诊断专家共识》)明确smn1发生双等位基因的致病性变异是sma诊断的主要依据，临床诊断或者临床疑似sma的患者均应进行基因检测。基因检测的目标基因为smn1基因和smn2基因。其中smn1基因拷贝数和致病性变异的检测结果用于疾病诊断或排除诊断，smn2基因拷贝数的检测结果作为患者诊断后的治疗、临床管理和预后评估的参考指标。由于在人类基因组中smn1基因和smn2基因高度同源，需分别针对smn1基因和smn2基因进行基因检测。smn1基因和smn2基因全长转录本在外显子7(c.840c/t)和外显子8(c.*239g/a)的差异碱基位点作为区分两个基因座的主要参考位点。由于95％的sma患者为smn1基因外显子7纯合缺失，应首先进行smn1基因外显子7拷贝数定量分析。若smn1基因第7外显子纯合缺失或第7、8外显子纯合缺失，即可诊断为smn1纯合缺失型患者。对于非纯合缺失变异，还需对smn1基因的致病性微小变异进行分析确认。基因诊断明确的患者，其父母有必要进行smn1基因检测，以便确定父母smn1基因型和患者变异基因的来源，并进行遗传咨询。

6、常用的smn1基因拷贝数检测方法包括多重连接探针扩增(mlpa)，定量聚合酶链反应法(qpcr)。sma传统的检测方法还包括双侧双重等位基因特异性pcr(as-pcr)、聚合酶链反应-变性高效液相色谱(pcr-dhplc)、pcr-sscp、pcr-rflp、dhplc、高分辨溶解曲线分析(hrma)、数字pcr等。mlpa可通过直接检测smn1拷贝数明确区分患者、携带者或正常人，还可同时检测smn2的拷贝数,但是mlpa操作复杂，成本高，且需要抗凝血提取纯化的基因组dna,不适合大规模的新生儿筛查。qpcr则以管家基因序列为内参，采用taqman探针法分别对smn1第7或第7、8外显子拷贝数进行相对定量来判断是否发生缺失变异；操作简单，成本低，但也需要抗凝血提取纯化的基因组dna，干血斑直接提取检测，会导致靶基因和内参基因扩增效率存在样本间差异，从而对携带者检测容易出现假阳性和假阴性结果。

7、现有技术中也有采用添加荧光染料或荧光探针进行熔解曲线方法检测smn1基因的拷贝数，但都是通过分别设计针对靶区域和内参区域的探针，通过扩增两个区域进行熔解曲线分析，通过两个区域的熔解峰强度比值检测靶区域的拷贝数变异，对靶区域和内参区是不同的基因序列，基因扩增效率会有差异，为了消减扩增效率不同的影响，采用极低的dntp浓度进行限制扩增，但会造成扩增的产物量显著降低，影响检测灵敏度，难以满足新生儿干血斑微量样本检测。直接设计荧光探针针对smn1基因和smn2基因在外显子7差异碱基位点(c.840c/t)进行检测，只能检测smn1双拷贝完全缺失的患者，不能检测单拷贝缺失的携带者，因为无法区分smn1与smn2拷贝数1：1和2：2的情况。

8、以上常规方法主要以抗凝血样本检测smn1外显子7拷贝数为主，不能检测smn1基因微小变异。因此在进行筛查有可能存在漏检，有研究表明高通量测序技术可以同时检测smn1基因拷贝数和筛查smn基因微小变异，但高通量测序技术操作复杂，步骤繁琐，仪器和试剂成本高，同样不适用大规模的新生儿筛查。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测脊髓性肌萎缩症致病基因smn1的引物探针组以及试剂盒。本发明提供的试剂盒克服了现有技术不足和缺陷，采用荧光探针熔解曲线技术同时进行smn1基因拷贝数和常见点突变的检测，可以检测包括干血斑/唾液在内的微量样本，能同时检测sma患者和携带者，具有耗时短、操作简便、特异性强、灵敏度高、准确性高并且成本低的优势。

2、smn1基因，全称为运动神经元存活基因1(survival motor neuron gene 1)。

3、本发明提供了一种试剂盒，包括基因检测液a、基因检测液b、基因检测液c。

4、所述试剂盒还包括前处理液和扩增反应液。

5、本发明还保护基因检测液a、基因检测液b和基因检测液c在制备试剂盒中的应用。

6、本发明还保护基因检测液a、基因检测液b、基因检测液c、前处理液和扩增反应液在制备试剂盒中的应用。

7、所述基因检测液a中含有引物f4、引物r4、引物f6、引物r6、引物f7、引物r7、探针fp4、探针q2、探针fp8、探针q5、探针fp9、探针fp10和探针q6。

8、基因检测液b中含有引物f4、引物r4、引物f6、引物r6、引物f5、引物r5、探针fp6、探针q4、探针fp7、探针fp11、探针q7、探针fp5和探针q3。

9、基因检测液c中含有引物f1、引物r1、引物f2、引物r2、引物f3、引物r3、探针fp1、探针fp2、探针q1、探针fp3和探针fb1。

10、基因检测液a中，引物f4、引物r4、引物f6、引物r6、引物f7、引物r7、探针fp4、探针q2、探针fp8、探针q5、探针fp9、探针fp10和探针q6的摩尔配比依次如下：1.5：15：12：1.2：1：10：6：6：6：6：5：5：5。

11、基因检测液b中，引物f4、引物r4、引物f6、引物r6、引物f5、引物r5、探针fp6、探针q4、探针fp7、探针fp11、探针q7、探针fp5和探针q3的摩尔配比依次如下：1.5：15：1：10：1.5：15：7.5：7.5：7.5：5：5：6：6。

12、基因检测液c中，引物f1、引物r1、引物f2、引物r2、引物f3、引物r3、探针fp1、探针fp2、探针q1、探针fp3、探针fb1的摩尔配比依次如下：1：10：1：10：10：1：5：5：5：5：2。

13、所述前处理液中含有chelex-100、triton-x100和naoh。

14、具体的，前处理液：含5％(质量百分比)chelex-100、0.2％(体积百分比)triton-x100、40mm naoh，余量为水。

15、所述扩增反应液中含有dna聚合酶、dntp、dutp和udg酶。

16、具体的，1人份(6.0μl)扩增反应液的组成见表4。

17、本发明还保护引物探针组，由引物f1、引物r1、引物f2、引物r2、引物f3、引物r3、引物f4、引物r4、引物f5、引物r5、引物f6、引物r6、引物f7、引物r7、探针fp1、探针fp2、探针q1、探针fp3、探针fb1、探针fp4、探针q2、探针fp5、探针q3、探针fp6、探针q4、探针fp7、探针fp8、探针q5、探针fp9、探针q6、探针fp10、探针fp11和探针q7组成。

18、本发明还保护所述引物探针组在制备试剂盒中的应用。

19、本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物探针组。

20、以上任一所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)检测smn1基因突变；(b)筛查脊髓性肌萎缩症患者；(c)筛查脊髓性肌萎缩症携带者。

21、引物f1为seq id no：1所示的单链dna分子；引物r1为seq id no：2所示的单链dna分子；引物f2为seq id no：3所示的单链dna分子；引物r2为seq id no：4所示的单链dna分子；引物f3为seq id no：5所示的单链dna分子；引物r3为seq id no：6所示的单链dna分子；引物f4为seq id no：7所示的单链dna分子；引物r4为seq id no：8所示的单链dna分子；引物f5为seq id no：9所示的单链dna分子；引物r5为seq id no：10所示的单链dna分子；引物f6为seq id no：11所示的单链dna分子；引物r6为seq id no：12所示的单链dna分子；引物f7为seq id no：13所示的单链dna分子；引物r7为seq id no：14所示的单链dna分子。

22、探针fp1为seq id no：15所示的单链dna分子；探针fp2为seq id no：16所示的单链dna分子；探针q1为seq id no：17所示的单链dna分子；探针fp3为seq id no：18所示的单链dna分子；探针fb1为seq id no：19所示的单链dna分子；探针fp4为seq id no：20所示的单链dna分子；探针q2为seq id no：21所示的单链dna分子；探针fp5为seq id no：22所示的单链dna分子；探针q3为seq id no：23所示的单链dna分子；探针fp6为seq id no：24所示的单链dna分子；探针q4为seq id no：25所示的单链dna分子；探针fp7为seq id no：26所示的单链dna分子；探针fp8为seq id no：27所示的单链dna分子；探针q5为seq id no：28所示的单链dna分子；探针fp9为seq id no：29所示的单链dna分子；探针q6为seq id no：30所示的单链dna分子；探针fp10为seq id no：31所示的单链dna分子；探针fp11为seq id no：32所示的单链dna分子；探针q7为seq id no：33所示的单链dna分子。

23、探针fp4、探针fp8、探针fp9和探针fp10，分别标记不同的荧光基团(即4种探针具有四种荧光基团)。

24、探针fp6、探针fp7、探针fp11和探针fp5，分别标记不同的荧光基团(即4种探针具有四种荧光基团)。

25、探针fp1、探针fp2和探针fp3，分别标记不同的荧光基团(即4种探针具有三种荧光基团)。

26、探针fp1，5'端末标记荧光基团，3'末端标记荧光淬灭基团；

27、探针fp2，5'末端标记荧光基团，3'端进行c3 spacer修饰；

28、探针q1，3'末端标记荧光淬灭基团；

29、探针fp3，5'末端标记荧光基团，3'末端标记荧光淬灭基团；

30、探针fp4，5'末端标记荧光基团，3'端进行c3 spacer修饰；

31、探针q2，3'末端标记荧光淬灭基团；

32、探针fp5，5'末端标记荧光基团，3'端进行c3 spacer修饰；

33、探针q3，3'末端标记荧光淬灭基团；

34、探针fp6，3'末端标记荧光基团；

35、探针q4，5'末端标记荧光淬灭基团，3'末端标记荧光淬灭基团；

36、探针fp7，5'末端标记荧光基团，3'端进行c3 spacer修饰；

37、探针fp8，5'末端标记荧光基团，3'端进行c3 spacer修饰；

38、探针q5，3'末端标记荧光淬灭基团；

39、探针fp9，3'末端标记荧光基团；

40、探针q6，5'末端标记荧光淬灭基团，3'末端标记荧光淬灭基团；

41、探针fp10，5'末端标记荧光基团，3'端进行c3 spacer修饰；

42、探针fp11，5'末端标记荧光基团，3'端进行c3 spacer修饰；

43、探针q7，3'末端标记荧光淬灭基团。

44、探针fp1，5'端末标记fam，3'末端标记bhq2；

45、探针fp2，5'末端标记cy5，3'端进行c3 spacer修饰；

46、探针q1，3'末端标记bhq2；

47、探针fp3，5'末端标记rox，3'末端标记bhq2；

48、探针fb1，第12个核苷酸和第13个核苷酸进行锁核酸修饰，3'端进行c3 spacer修饰；

49、探针fp4，5'末端标记cy5，3'端进行c3 spacer修饰；

50、探针q2，3'末端标记bhq2；

51、探针fp5，5'末端标记rox，3'端进行c3 spacer修饰；

52、探针q3，3'末端标记bhq2；

53、探针fp6，3'末端标记fam；

54、探针q4，5'末端标记bhq1，3'末端标记bhq1；

55、探针fp7，5'末端标记hex，3'端进行c3 spacer修饰；

56、探针fp8，5'末端标记rox，3'端进行c3 spacer修饰；

57、探针q5，3'末端标记mgb；

58、探针fp9，3'末端标记fam；

59、探针q6，5'末端标记bhq1，3'末端标记bhq1；

60、探针fp10，5'末端标记hex，3'端进行c3 spacer修饰；

61、探针fp11，5'末端标记cy5，3'端进行c3 spacer修饰；

62、探针q7，3'末端标记mgb。

63、本发明提供的试剂盒的工作原理为原理一、原理二和原理三。

64、原理一和原理二的示意图见图1。

65、原理一如下：

66、针对smn1基因外显子7(c.840c/t；smn1基因为c.840c，smn2基因为c.840t)和外显子8(c.*239g/a；smn1基因为c.*239g，smn2基因为c.*239a)的两个靶点，设计上下游引物，采用非对称pcr扩增包含靶点区域的单链dna。

67、根据靶点设计荧光检测探针，为自淬灭探针或者相邻淬灭探针组。自淬灭探针的一端标记荧光基团，另一端标记荧光淬灭基团；没有靶标存在时，探针自然卷曲，荧光基团和荧光淬灭基团靠近，从而荧光被淬灭；当有靶标存在时，探针与靶标杂交，荧光基团和荧光淬灭基团距离拉开，从而荧光信号出现。相邻淬灭探针组由两条探针组成，一条为荧光探针(标记有荧光基团，荧光探针的靶标区域覆盖靶标位点)，另外一条为淬灭探针(标记有荧光淬灭基团，荧光淬灭探针的靶标区域与荧光探针的靶标区域相邻)；当靶标存在时，荧光探针和淬灭探针杂交在靶标上，距离接近，荧光基团被荧光淬灭基团淬灭；当靶标不存在时，荧光探针和淬灭探针距离拉开，荧光探针出现荧光信号。

68、c.840位点和c.*239位点不同的分型与探针结合力不同，导致熔解曲线中的tm出现差异，从而根据tm值分布，判断基因分型。利用smn1基因和smn2基因的差异位点，探针与smn1基因完全匹配，与smn2基因不完全匹配，因此，smn1基因的扩增产物产生高tm值的熔解峰，smn2基因的扩增产物产生低tm值的熔解峰。如果高tm值熔解峰缺失，则说明smn1基因两个拷贝完全缺失。如果高tm值熔解峰和低tm值熔解峰强度相等，可能为“smn1基因：smn2基因拷贝数为1：1”，也可能为“smn1基因：smn2基因拷贝数为2：2”，因此不能直接判断是否为smn1基因单拷贝缺失。

69、原理二如下：

70、为了实现分析smn1基因单拷贝缺失(携带者)，采用同源基因扩增对比分析方法，在smn1基因外显子7区域附近选择靶区(smn1-target)，在全基因组比对与该靶区高度同源的参考区域(smn1-ref)，且高度同源区域不超过2个，针对筛选的高度同源区域设计pcr扩增上下游引物，采用相同引物同时扩增smn1-target和smn1-ref。因为smn1基因和smn2基因高度同源，为了避免smn2基因的干扰，根据smn1基因和smn2基因的差异位点ins7+100(smn1为ins7+100a，smn2为ins7+100g)设计阻滞引物(引物3'端与smn1基因相差1个碱基，与smn2基因相差2个碱基)，并设计封闭探针(封闭探针覆盖ins7+100位点和引物3'端位置，封闭探针与smn2基因ins7+100g完全匹配，并在ins7+100g碱基采用锁苷酸修饰，确保封闭探针优先与smn2基因结合，避免smn2基因干扰)。设计荧光检测探针，该荧光检测探针的杂交区域选择smn1-target和smn1-ref中有碱基差异的序列，从而对smn1-target和smn1-ref通过不同tm熔解峰进行区分，高tm值的熔解峰为smn1基因扩增产物，低tm值熔解峰为基因组同源参考区域扩增产物。当smn1基因发生拷贝数缺失时，smn1基因与同源参考区域的模板比值发生改变，由2：2变成1：2或者0：2,因为采用相同扩增引物，当模板比值发生明显改变时，导致扩增产物比例也发生明显改变，从而熔解峰强度比值发生改变，由此进行smn1基因单拷贝缺失、双拷贝缺失检测。

71、原理三如下：

72、为了实现同时分析smn1基因常见突变位点，针对中国人群中最常见的突变位点(见表1)设计扩增引物。设计引物分别扩增相应突变位点。根据靶点设计荧光检测探针，为自淬灭探针或者相邻淬灭探针组。如果检测位点发生突变，探针熔解峰会改变，出现低tm值的熔解峰或者高tm值的熔解峰，从而判断是野生型、杂合突变型还是纯合突变型。

73、表1

74、 序号 突变位点以及突变形式 1 c.22dupa(p.ser8lys fs*23) 2 c.683t>a(p.leu228*) 3 c.689c>t(p.ser230leu) 4 c.863g>t(p.gly279glufs*5) 5 c.400g>a(p.glu134lys) 6 c.835-5t>g(p.gly279glufs*5) 7 c.463_464delaa(p.asn155cysfs*5) 8 c.5c>g(p.ala2gly) 9 c.40g>t(p.glu13x) 10 c.43c>t(p.glu14x) 11 c.56delt(p.val19glyfs*21)

75、本发明提供的试剂盒可以检测smn1基因双拷贝缺失、单拷贝携带以及常见突变(即表1所示突变)，从而减少漏检率。本发明提供的试剂盒，采用同源区域扩增，使用正常dntp浓度，特异检测靶区域的拷贝数变异，不影响检测灵敏度。现有技术中的基因检测试剂需要较多血样并纯化基因组dna，不适合应用于新生儿干血斑筛查。本发明提供的试剂盒，可以直接对微量血样(3μl血液或者3mm干血斑)进行前处理，处理液直接进行后续扩增检测，不需要进行基因组dna纯化等繁琐步骤，节约了成本和时间，适合新生儿干血斑筛查检测。本发明提供试剂盒，可以针对微量唾液样本进行smn1基因携带者检测，适合在正常人群、备孕人群中进行携带者筛查，有效进行sma的三级防控。

76、本发明的有益效果：(1)通过三个pcr反应完成smn1基因检测，同时检测外显子7和8纯合缺失、外显子7单拷贝缺失和常见突变(即表1所示突变)，可以有效减少漏检，并且检测成本低，通量高，操作便捷，用时短(2.5小时完成检测)；(2)灵敏度达2ng；(3)可实现微量干血斑直接检测，有利于进行新生儿筛查；(4)可实现微量唾液样本直接检测，有利于通过无创形式进行大规模人群的携带者筛查；(5)采用荧光探针多重熔解曲线，采用同源基因比对分析，根据基因组同源序列设计smn1外显子7附近区域的扩增引物和探针，实现cnv检测，相对taqman探针法提高了检测特异性。