红曲米红曲霉重组PSTF基因及其应用的制作方法

本发明属于红曲米红曲霉分子生物学领域，具体涉及红曲米红曲霉重组pstf基因及其应用。

背景技术：

1、红曲米以籼稻、粳稻、糯米等稻米为原料，用红曲霉菌(monascus purpureus)发酵而成，为棕红色或紫红色米粒，具有独特的色泽和风味。红曲米有活血化瘀的功效，可以用于辅助治疗赤白下痢、产后恶露不尽、跌打损伤等病症。红曲米具有降低总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血清甘油三酯、动脉粥样硬化指数，升高高密度脂蛋白胆固醇的疗效，对防治心脑血管疾病、降压降脂有重要意义。红曲米含有蛋白质、脂肪、糖类、维生素及钙、磷、铁等营养元素。红曲米具有降血压、降血脂的作用，所含红曲米霉素k可阻止生成胆固醇。红曲米含有丰富的淀粉与植物蛋白质，可补充消耗的体力及维持身体正常体温。

2、红曲霉(monascus purpureus)是红曲米发酵中的特殊曲种，其历史悠久，在我国古代又称“丹曲”。红曲色素和桔霉素都是由红曲霉代谢产生的聚酮体化合物，因此在合成途径上具有一定的相关性。红曲色素和桔霉素共用同一条四酮体化合物合成途径，随后出现分支，桔霉素是由四酮体化合物(丁酮)中间体直接代谢合成，而色素则是进一步合成的六酮体化合物(己酮)。红曲色素为红色或者暗红色液体或粉末状物，易溶于乙醇、丙二醇、丙三醇及其水溶液，其溶解度与溶液的ph有关。在中碱性条件下极易溶解，当介质中的ph值低于4.0时，其溶解度就会降低。根据其颜色的不同红曲色素可分为橙色素、红色素和黄色素三大类，此类色素对热敏感，在极端的ph值条件下不稳定，且见光分解。桔霉素对热亦不稳定，具有肾毒性和致畸性，其甲醇溶解液在250nm和333nm处有最大的紫外吸收峰，难溶于水，可溶于氢氧化钠、碳酸钠、甲醇、乙睛等溶剂。由于桔霉素和红曲色素的合成途径具有相关性，在获得色素的同时也会伴随有桔霉素的产生，这严重阻碍了红曲霉在食品中的应用。因此，研究红曲色素和桔霉素的代谢机制，筛选红曲色素和桔霉素代谢的关键基因对培育优良红曲霉菌种至关重要。

3、现有技术存在的问题：现有技术中未见红曲聚酮合酶转录因子的报道，本申请通过对转录组数据的分析，筛选得到两个红曲聚酮合酶转录因子基因，通过基因工程表达分析得出两个基因均对红曲色素的合成具有关键作用，并且pstf1基因通过编辑修改5个碱基后能够显著增强红曲色素合成速率，并同时抑制桔霉素的合成。

技术实现思路

1、本发明要解决的关键技术问题在于通过提供红曲聚酮合酶转录因子及其应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

2、1.红曲霉聚酮合酶转录因子1(polyketide synthase transcription factor 1,pstf1)，所述pstf1转录本序列如序列表seq id no.1所示，包含1518bp，其中173-1288bp为cds区。

3、2.重组(编辑)红曲霉聚酮合酶转录因子1(genome editing polyketidesynthase transcription factor 1,gepstf1)编辑重组序列，所述gepstf1转录本序列如序列表seq id no.2所示，与pstf1相比其cds的464位和467位由g改为c，904位，913位，919位由c改为g。经过编辑后464位和467位的密码子翻译由甘氨酸改为丙氨酸，904位，913位，919位的密码子翻译由脯氨酸改为丙氨酸。

4、3.红曲霉聚酮合酶转录因子2(polyketide synthase transcription factor 2,pstf2)，所述pstf2转录本序列如序列表seq id no.3所示，包含1884bp，其中217-1671bp为cds区。

5、4.pstf1和pstf1的克隆方法，包括：(1)从公布的文献下载公布的monascuspurpureus转录组数据，在线protein analysis through evolutionary relationships(http://www.pantherdb.org/)进行gene ontology功能分析，筛选红曲聚酮合酶转录因子功能注释的基因。将筛选到的序列设计克隆引物得到forward primer：aagatgcccacaagaacgagg，reverse primer：cgaggtgttgctggatgtgg。采用北京天根试剂盒按说明书操作进行克隆，其中退火温度tm 61℃，预期扩增片段为1254bp。目的基因采用市售或本公司保存的古田红曲霉，按天根试剂盒说明书提取rna并转录得cdna。(2)采用全式金试剂盒按说明书操作将该片段连接到pmd-19t载体，并转入e.coli dh5α中，获得的阳性克隆委托上海生工测序确定。

6、5.pstf基因功能验证方法，包括：(1)根癌农杆菌诱导培养，(2)古田红曲霉培养，(3)根癌农杆菌与古田红曲霉共培养转化，(4)阳性转化筛选。

7、6.pstf1基因在增加红曲霉产量中的应用，所述pstf1转录本序列如序列表seq idno.1所示。

8、7.gepstf1基因在增加红曲霉产量中的应用，所述gepstf1转录本序列如序列表seq id no.2所示。

9、8.gepstf1基因在降低桔霉素产量中的应用，所述gepstf1转录本序列如序列表seq id no.2所示，gepstf1是将pstf1的cds的464位和467位由g改为c，904位，913位，919位由c改为g，经过编辑后464位和467位的密码子翻译由甘氨酸改为丙氨酸，904位，913位，919位的密码子翻译由脯氨酸改为丙氨酸。

10、9.pstf2基因在增加红曲霉产量中的应用，所述pstf2转录本序列如序列表seq idno.3所示。

11、10.pstf2基因在在降低桔霉素产量中的应用，所述pstf2转录本序列如序列表seqid no.3所示。

12、有益效果：本发明首次报道红曲霉聚酮合酶转录因子及其功能，本申请通过对转录组数据的分析，筛选得到两个红曲聚酮合酶转录因子基因，通过基因工程表达分析得出两个基因均对红曲色素的合成具有关键作用，并且pstf1基因通过编辑修改5个碱基后能够显著增强红曲色素合成速率，并同时抑制桔霉素的合成。

技术特征：

1.红曲霉pstf1基因，其特征在于所述pstf1转录本序列如序列表seq id no.1所示，包含1518bp，其中173-1288bp为cds区。

2.重组红曲霉gepstf1基因，其特征在于所述gepstf1转录本序列如序列表seq idno.2所示，gepstf1是在pstf1的cds的464位和467位由g改为c，904位，913位，919位由c改为g；经过编辑后464位和467位的密码子翻译由甘氨酸改为丙氨酸，904位，913位，919位的密码子翻译由脯氨酸改为丙氨酸。

3.红曲霉pstf2基因，其特征在于所述pstf2转录本序列如序列表seq id no.3所示，包含1884bp，其中217-1671bp为cds区。

4.红曲霉pstf1基因在增加红曲霉产量中的应用，其特征在于所述pstf1转录本序列如序列表seq id no.1所示。

5.红曲霉gepstf1基因在增加红曲霉产量中的应用，其特征在于所述gepstf1转录本序列如序列表seq id no.2所示。

6.红曲霉gepstf1基因在降低桔霉素产量中的应用，其特征在于所述gepstf1转录本序列如序列表seq id no.2所示。

7.红曲霉pstf2基因在增加红曲霉产量中的应用，其特征在于所述pstf2转录本序列如序列表seq id no.3所示。

8.红曲霉pstf2基因在在降低桔霉素产量中的应用，其特征在于所述pstf2转录本序列如序列表seq id no.3所示。

9.红曲霉pstf1和pstf1的克隆方法，其特征在于包括：(1)从公布的文献下载公布的monascus purpureus转录组数据，在线protein analysis through evolutionaryrelationships进行gene ontology功能分析，筛选红曲聚酮合酶转录因子功能注释的基因.将筛选到的序列设计克隆引物，采用北京天根试剂盒按说明书操作进行克隆，(2)采用全式金试剂盒按说明书操作将该片段连接到pmd-19t载体，并转入e.coli dh5α中，获得的阳性克隆委托上海生工测序确定。

10.红曲霉pstf基因功能验证方法，其特征在于所述验证方法包括：(1)根癌农杆菌诱导培养，(2)古田红曲霉培养，(3)根癌农杆菌与古田红曲霉共培养转化，(4)阳性转化筛选。

技术总结
本发明提供了红曲米红曲霉聚酮合酶转录因子基因及其增加红曲色素合成速率和抑制桔霉素的合成的应用。本申请筛选得到两个红曲聚酮合酶转录因子基因，通过基因工程表达分析得出两个基因均对红曲色素的合成具有关键作用。此外，PSTF1基因通过人工编辑修改5个碱基后能够显著增强红曲色素合成速率，并同时抑制桔霉素的合成。

技术研发人员：李秋松,李敏,谢昌荣,林妙丽,曾雪珍
受保护的技术使用者：福建耘福食品有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13