一种抗HLA-G2及HLA-G6分子的单克隆抗体及用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及抗hla-g2及hla-g6异构体分子抗体 (ywhg-26)的以下方面：采用hla-g2及hla-g6异构体共有序列，位于α1和α3连 接区的抗原肽(rgyynqseakppkthvthhpv)为免疫原，制备抗hla-g分子的单克隆 抗体(ywhg-26)；编码本发明所述ywhg-26抗体的核苷酸及其编码的氨基酸序 列，以及所述抗体(ywhg-26)用于hla-g2及hla-g6异构体分子免疫印迹及免疫 组化等检测的用途。

背景技术：

1、人类白细胞抗原-g(human leukocyte antigen-g,hla-g)基因，全长6.0kb， 位于人类第6号染色体短臂远侧6p21.3。在蛋白质翻译过程中，hla-g mrna第 1外显子编码信号肽，第2、3和第4外显子分别编码细胞外区的α1、α2和α3 结构域，第5位外显子编码跨膜区；第6外显子编码仅含6个氨基酸残基的hla-g 分子胞内段；由于外显子6内含有终止密码子，第7外显子不被转录；第8外显 子对应于hla-g基因的3′utr。hla-g初始转录产物经选择性剪接，可产生7 种成熟mrna，分别编码7种不同分子量的异构体分子(hla-g1、-g2、-g3、-g4、-g5、-g6及hla-g7)。其中hla-g1、hla-g2、hla-g3及hla-g4含有跨细胞膜 区，为膜结合型异构体；hla-g5、hla-g6及hla-g7缺乏跨细胞膜结构，为可溶 性异构体。hla-g1～-g7异构体分子的分子量分别为39kd,31kd,22kd,30kd, 34kd,23kd及16kd。

2、hla-g1是由全长hla-g mrna编码，由胞外区α1、α2及α3结构域，跨膜 区及胞内结构域组成。hla-g2缺乏α2结构域，由胞外区α1及α3结构域，跨 膜区及胞内结构域组成；hla-g3缺乏α2和α3结构域，由胞外区α1结构域， 跨膜区及胞内结构域组成；hla-g4缺乏α3结构域，由胞外区α1及α2结构域， 跨膜区及胞内结构域组成；胞外区结构域分别与hla-g1及hla-g2相同，但它们 由含有内含子4的hla-g mrna编码，因内含子4中含有终止密码子，所编码的 蛋白分子缺乏由外显子5所编码的跨膜区，形成可溶性hla-g分子。编码hla-g7 的mrna由于内含子2中含有终止密码子，胞外区仅含α1结构域及由内含子2 所编码的2个氨基酸残基相连(图1)。

3、在正常生理情况下，hla-g分子仅表达在母胎界面的绒毛外滋养层细胞，维 持妊娠过程中的母胎免疫耐受。病理情况下，hla-g分子能在肿瘤细胞及病毒感 染等病理组织细胞中诱导性表达，与疾病的发生及进展密切相关。hla-g分子是 体内一个重要的免疫致耐分子，也是一种重要的免疫检查点分子，其免疫抑制功 能主要通过结合免疫抑制性受体免疫球蛋白样转录物-2(immunoglobulin-like transcript-2,ilt2/lilrb1/cd85j)、免疫球蛋白样转录物-4 (ilt4/lilrb2/cd85d),传递抑制信号，诱导免疫耐受。具体作用机制有：①与 表达在t细胞、nk细胞和b细胞上的ilt-2结合，抑制t细胞和nk细胞免疫杀 伤活性，抑制b细胞增殖和抗体分泌等功能。②与树突状细胞(dc)上表达的 ilt-2、ilt-4结合，抑制dc细胞的成熟和分化，诱导产生耐受性dc细胞。③ 与骨髓来源抑制性细胞(mdsc)和巨噬细胞(mф)上表达的ilt-2、ilt-4结合， 诱导促炎抗肿瘤的m1型巨噬细胞向免疫致耐性m2型巨噬细胞分化等。因此， hla-g在肿瘤等疾病的发生发展中起到重要作用。基于hla-g为靶点的多项肿瘤 免疫靶向治疗已在美国等进入i期临床试验。

4、hla-g与受体ilt-2、ilt-4结合，具有分子结构特异性。受体ilt-2、ilt-4 与hla-g结合的位点hla-g胞外区α3结构域。ilt-2仅结合hla-g/β2m复合物， 而ilt-4不仅可以与hla-g/β2m结合，同时可以与不含β2m的游离hla-g分子结 合。由于hla-g1、-g2、-g3、-g4、-g5、-g6及hla-g7异构体分子在表达机制 及分子结构上存在差异。ilt-2能与hla-g1和hla-g结合，而ilt-4能与hla-g1， hla-g2，hla-g5及hla-g6异构体分子结合。如hla-g3、-g4、及hla-g7异构体 胞外区不含α3结构域，不能与ilt-2和ilt-4结合。不同hla-g异构体分子可在病理生理过程中发挥特定的免疫学效应。目前，基于hla-g及ilt相关肿瘤靶 向治疗已陆续开展开展，hla-g异构体表达存在广泛的异质性，不同hla-g分子 异构体的表达具有特定的临床意义。因此，分析特定hla-g异构体分子表达及不 同hla-g异构体分子表达谱，对于阐述特定hla-g异构体分子的生物学功能及其 临床意义具有重要意义。

5、目前国内外用于hla-g分子免疫组化和免疫印迹的抗体有4h84，mem-g1及mem-g2。其中抗体4h84，其识别位点位于hla-g分子均具有的胞外区α1结构域， 能够检测目前已知含有α1结构域的7种hla-g异构体分子(hla-g1，hla-g2， hla-g3，hla-g4，hla-g5，hla-g6及hla-g7)，但在免疫组化中不能区分具体 特定hla-g异构体分子的表达。抗体mem-g1及mem-g2由全长hla-g重链免疫小 鼠得到，具体识别位点无法预测。抗体mem-g1及mem-g2抗体在理论上与抗体 4h84相似，能够识别上述hla-g异构体分子，但同样不能区分具体特定hla-g异构体分子的表达。

6、目前尚无针对hla-g2及hla-g6异构体分子的特异性单克隆抗体。因此，在 靶向精准医疗的背景下，迫切需要开发更多特异性和亲和力更好的抗hla-g分子 的单克隆抗体。

技术实现思路

1、鉴于目前尚无针对hla-g2及hla-g6异构体分子的特异性单克隆抗体，本发明 的目的是提供一种抗hla-g2及hla-g6异构体分子的特异性单克隆抗体 (ywhg-26)、编码本发明所述抗体(ywhg-26)的核苷酸序列及其编码的氨基酸 序列；以及所述ywhg-26抗体用于免疫印迹及免疫组化等检测的用途。

2、本发明采用采用hla-g2及hla-g6异构体共有序列，位于α1和α3连接区的抗原 肽(rgyynqseakppkthvthhpv)为免疫原，其氨基酸序列为seq id no.19所示氨 基酸序列(rgyynqseakppkthvthhpv)(图1虚框内所示区域)，并基于此制备抗 hla-g2及hla-g6异构体分子的特异性单克隆抗体(ywhg-26)。

3、根据发明人的研究成果，本发明提供了一种抗hla-g2及hla-g6异构体分子的 单克隆抗体(ywhg-26)，至少包括轻链高变区cdr1、cdr2和cdr3中的一种或多 种，或/和重链高变区cdr1、cdr2和cdr3中的一种或多种；

4、所述单克隆抗体(ywhg-26)抗体轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示或经 替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seqid no.1所示序列具有同等功 能的氨基酸序列；所述抗体轻链高变区cdr1的氨基酸序列为seq id no.2所示的 序列qsivhsngnty或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.2 所示的序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链高变区cdr2的氨基酸序列为 seq id no.3所示的序列kvs或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与 seq id no.3所示的序列具有同等功能的氨基酸序列，和所述轻链高变区cdr3 的氨基酸序列为seq id no.4所示的序列fqgshvplt或经替换、缺失或添加一个 或多个氨基酸形成的与seq id no.4所示的序列具有同等功能的氨基酸序列；

5、所述单克隆抗体(ywhg-26)抗体重链的氨基酸序列如seq id no.5所示或经 替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.5所示序列具有同等功 能的氨基酸序列；所述抗体重链高变区cdr1的氨基酸序列为seq id no.6所示的 序列gyafstyw或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.6所 示的序列具有同等功能的氨基酸序列，所述重链高变区cdr2的氨基酸序列为seq id no.7所示的序列iypgdgdt或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与 seq id no.7所示序列具有同等功能的氨基酸序列，和所述重链高变区cdr3的氨 基酸序列为seq id no.8所示的序列arvyygngfay或经替换、缺失或添加一个或 多个氨基酸形成的与seq id no.8所示的序列具有同等功能的氨基酸序列。

6、进一步地，所述单克隆抗体(ywhg-26)还包括轻链框架区(framework region，fr)和重链框架区；其中，所述轻链框架区包括轻链fr1、fr2、fr3和 fr4中的一种或多种，所述轻链fr1的氨基酸序列为seq id no.9所示的序列 dimltqtplslpvslgdqasiscrss或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸 形成的与seq id no.9所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链fr2的氨 基酸序列为seq id no.10所示的序列lewylqkpgqspklliy或经替换、缺失或添加 一个或多个氨基酸形成的与seq id no.10所示序列具有同等功能的氨基酸序列； 所述轻链fr3的氨基酸序列为seq id no.11所示的序列 nrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyyc或经替换、缺失或添加一个或多个氨基 酸形成的与seq id no.11所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链fr4 的氨基酸序列为seq id no.12所示的序列fgagtklelk或经替换、缺失或添加一 个或多个氨基酸形成的与seq id no.12所示序列具有同等功能的氨基酸序列； 所述重链框架区包括重链fr1、fr2、fr3和fr4中的一种或多种，其中：所述重链 fr1的氨基酸序列为seq id no.13所示的序列lgqlqesgaelvrpgssvkisckas或经 替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq idno.13所示序列具有同等 功能的氨基酸序列；所述重链fr2的氨基酸序列为seq id no.14所示的序列 mnwvkqrpgqglewigq或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有与seq id no.14所示序列同等功能的氨基酸序列；所述重链fr3的氨基酸序列为seq idno.15所示的序列ryngkfkgkatltadkssstaymqlssltsedsavyfc或经替换、缺失或 添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.15所示序列具有同等功能的氨基酸 序列；所述重链fr4的氨基酸序列为seq id no.16的序列wgqgtlltvsa或经替换、 缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.16所示序列具有同等功能的 氨基酸序列；

7、进一步地，所述单克隆抗体(ywhg-26)中编码轻链的核苷酸序列为seq id no.17所示的序列或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的与seq id no.17所示序列具有同等功能的核苷酸序列，所述单克隆抗体(ywhg-26)中 编码重链的核苷酸序列为seq id no.18所示的序列或该序列经替换、缺失或添加 一个或多个核苷酸形成的与seqid no.18所示序列具有同等功能的核苷酸序列。

8、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种优选的抗hla-g2及hla-g6异构体 分子的单克隆抗体(ywhg-26)，所述单克隆抗体(ywhg-26)由保藏编号为cctcc no:c202240的杂交瘤产生，分类命名杂交瘤细胞株ywhg-26，保藏机构为：中国 典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年3月8日，中国典型培养物保藏中心的地 址是中国.武汉.武汉大学，邮编430072。

9、本发明还提供了所述抗hla-g分子抗体(ywhg-26)用于hla-g分子免疫印迹 及免疫组化等检测的用途，具有特异性高，亲和力强等特点。

10、为更清楚了解本技术的发明构思和技术方案，下文将通过具体实施例和附图 进一步解释本技术，其中关于实施方式中的技术方案仅是优选的实施方式，不应 被解释为限制本技术的范围。对于本领域技术人员来说，在不脱离本技术的技术 原理的前提下，还可以做出若干改进和调整，这些改进和调整也应视为落入本申 请的保护范围之中。

11、除非另有定义，本文使用的所有科技术语应视为具有本领域普通技术人员所 理解的相同含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用氨基酸的标 准3字母和/或1字母代码。

12、本发明中提及的轻链高变区或重链高变区，其中“高变区”又被称之为互补 决定区(complementarity determining region，cdr)。

13、本发明中提及的“序列”可以指包含某些生物学功能等同的氨基酸序列或“保 守性替代”，“其它序列”可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”， 其经基因工程改造以改进cdr或含cdr抗体的特性。在不实质性地影响抗体活性的 前提下，本领域技术人员可以对本技术中的序列进行操作，即替换、添加和/或 缺失一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或多个)氨基酸，以获 得所述抗体或其功能性片段序列的变体。它们应被视为包括在本技术保护的范围 内。例如，在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明中提及的变体的 序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。序列 一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序blast，尤 其是blastp或tblastn。本文所述的多种氨基酸序列详见序列表。