靶向CD5和CD7的通用CAR-T及其应用的制作方法

本文涉及制备通用嵌合抗原受体t细胞(ucar-t)的方法。本文还涉及ucar-t在癌症治疗方面的应用。

背景技术：

1、相比自体car-t，通用car-t(universal car-t,简称ucar-t)具有诸多优势，但同时也面临着诸多的挑战，其中最主要的两大难题是其一：由于异体细胞输注而导致的移植物抗宿主病gvhd，其二：ucar-t在宿主体内被宿主免疫系统快速清除，而无法有效扩增。所以目前的ucar-t主要围绕着解决这两个难题而设计。

2、目前，第一个难题已基本得到解决。研究人员通过基因编辑技术，敲除αβ-t细胞上编码t细胞表面受体(tcr)的trac基因1-3，有效抑制car-t细胞通过激活tcr对宿主细胞进行无差别的攻击，从而避免gvhd的发生。

3、相比之下，第二个问题更难解决。近年来研究者一直在探究如何使ucar-t细胞在宿主体内进行有效扩增。目前主流的解决方案有两种：

4、(1)通过cd52单抗药物和通用car-t联合使用。应用cd52蛋白的单克隆抗体药alemtuzumab和化疗药物清淋后，给患者输注trac/cd52双敲除的car-t细胞进行治疗。该方案中敲除trac预防移植物抗宿主病，敲除cd52预防清淋药物对ucar-t的清除2。

5、(2)另一种为了降低宿主排斥移植物反应的策略，是敲除ucar-t上的编码β2-微球蛋白的b2m基因3,4。破坏β2-微球蛋白(b2m敲除)可阻止功能性hla-i类分子在car-t细胞表面表达。该方案通过破坏hla-i类分子，避免了ucar-t激活宿主体内的细胞毒性t细胞，从而使其获得长期增殖。然而，由于hla是nk细胞的抑制性配体，它的缺失会激活患者nk细胞对car-t细胞进行清除，使其在体内的扩增受限，影响其有效性。

6、cd5和cd7是靶向t细胞恶性肿瘤治疗的两个有潜力的靶点5。许多t细胞恶性肿瘤表达cd7，大多数t-nhl和t-all高表达cd7，且除了t细胞恶性肿瘤，cd7在约24％的aml中表达，被认为是白血病干细胞的标记物，并在绝大多数自然杀伤细胞(nk)和nkt nhls和白血病中表达6，这为t细胞癌的免疫治疗提供了一个有吸引力的靶点。

7、cd5是一种泛t细胞标记物，在大多数t细胞恶性肿瘤中普遍过表达，正常细胞cd5的表达仅限于胸腺细胞、外周t细胞和少量的b淋巴细胞亚群，称为b-1细胞。此外，cd5是t细胞受体(tcr)信号的负调节因子，并在保护自身免疫中发挥作用7。

8、在国内，目前已知以cd5和cd7为靶点进行产品开发的公司较少，其中有的产品为自体cd7-car-t，目前处于ind申报阶段；有的为通用cd7-car-t，分别处于iit和i期临床实验阶段。目前还没有公司以cd5和cd7为靶点的双靶car-t开发的相关报道。

技术实现思路

1、在一方面，本文提供了制备通用嵌合抗原受体t细胞(ucar-t)的方法，包括：

2、1)利用crispr基因编辑系统制备如下基因被敲除的t细胞：

3、i)trac基因和/或trbc基因；

4、ii)cd5基因；

5、iii)cd7基因；以及

6、2)以包括嵌合抗原受体(car)的编码序列的核酸分子转染所述t细胞，使其表达所述car。

7、在一些实施方案中，在步骤1)中还包括敲除所述t细胞的b2m基因。

8、在一些实施方案中，对所述trac基因的敲除所使用的sgrna的靶序列选自seq idno：1-7所示序列及其任意组合。

9、在一些实施方案中，对所述b2m基因的敲除所使用的sgrna的靶序列选自seq idno：8、9、11、12所示序列及其任意组合。

10、在一些实施方案中，对所述b2m基因的敲除使用两种sgrna的组合，所述两种sgrna的靶序列分别为seq id no：9和11所示序列。

11、在一些实施方案中，在步骤1)中将用于所述trac基因敲除和用于所述b2m基因敲除的sgrna与cas9蛋白混合后同时进行所述t细胞中所述trac基因和所述b2m基因的敲除，并且用于所述trac基因敲除的sgrna的靶序列为seq id no：7所示序列。

12、在一些实施方案中，用于敲除所述cd5基因的sgrna的靶序列选自seq id no：13、14、16、17、18、19所示序列及其任意组合。

13、在一些实施方案中，用于所述cd7基因敲除的sgrna的靶序列为seq id no：20所示序列。

14、在一些实施方案中，对所述trac基因、所述cd5基因和所述cd7基因的敲除同时进行，用于敲除所述trac基因的sgrna的靶序列为seq id no：7所示序列；用于敲除所述cd5基因的sgrna的靶序列为seq id no：13所示序列；以及用于敲除所述cd7基因的sgrna的靶序列为seq id no：20所示序列。

15、在一些实施方案中，对所述trac基因、所述b2m基因、所述cd5基因和所述cd7基因的敲除同时进行，用于敲除所述trac基因的sgrna的靶序列为seq id no：7所示序列；用于敲除所述b2m基因的两种sgrna的靶序列分别为seq id no：9和11所示系列；用于敲除所述cd5基因的sgrna的靶序列为seq id no：13所示序列；以及用于敲除所述cd7基因的sgrna的靶序列为seq id no：20所示序列。

16、在一些实施方案中，对所述trac基因、所述cd5基因和所述cd7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μl体系中包括：

17、不少于30pmol的cas9和不少于45pmol的靶向seq id no：7所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

18、不少于40pmol的cas9和不少于120pmol的靶向seq id no：13所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；以及

19、不少于40pmol的cas9和不少于120pmol的靶向seq id no：20所示序列的sgrna所形成的rnp复合物。

20、在一些实施方案中，对所述trac基因、所述b2m基因、所述cd5基因和所述cd7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μl体系中包括：

21、不少于30pmol的cas9和不少于45pmol的靶向seq id no：7所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

22、不少于20pmol的cas9和不少于30pmol的靶向seq id no：9所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

23、不少于20pmol的cas9和不少于30pmol的靶向seq id no：11所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

24、不少于40pmol的cas9和不少于120pmol的靶向seq id no：13所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；以及

25、不少于40pmol的cas9和不少于120pmol的靶向seq id no：20所示序列的sgrna所形成的rnp复合物。

26、在一些实施方案中，对所述trac基因、所述cd5基因和所述cd7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μl体系中包括：

27、30pmol的cas9和45pmol的靶向seq id no：7所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

28、80pmol的cas9和150pmol的靶向seq id no：13所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；以及

29、40pmol的cas9和120pmol的靶向seq id no：20所示序列的sgrna所形成的rnp复合物。

30、在一些实施方案中，对所述trac基因、所述b2m基因、所述cd5基因和所述cd7基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μl体系中包括：

31、30pmol的cas9和45pmol的靶向seq id no：7所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

32、20pmol的cas9和30pmol的靶向seq id no：9所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

33、20pmol的cas9和30pmol的靶向seq id no：11所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

34、80pmol的cas9和150pmol的靶向seq id no：13所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；以及

35、40pmol的cas9和120pmol的靶向seq id no：20所示序列的sgrna所形成的rnp复合物。

36、在一些实施方案中，在步骤1)中还包括敲除所述t细胞的ciita基因。

37、在一些实施方案中，用于所述ciita基因敲除的sgrna的靶序列为seq id no：25所示序列。

38、在一些实施方案中，对所述trac基因、所述b2m基因、所述cd5基因、所述cd7基因和所述ciita基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μl体系中包括：

39、不少于30pmol的cas9和不少于45pmol的靶向seq id no：7所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

40、不少于20pmol的cas9和不少于30pmol的靶向seq id no：9所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

41、不少于20pmol的cas9和不少于30pmol的靶向seq id no：11所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

42、不少于80pmol的cas9和不少于150pmol的靶向seq id no：13所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

43、不少于40pmol的cas9和不少于120pmol的靶向seq id no：20所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；以及

44、不少于40pmol的cas9和不少于60pmol的靶向seq id no：25所示序列的sgrna所形成的rnp复合物。

45、在一些实施方案中，对所述trac基因、所述b2m基因、所述cd5基因、所述cd7基因和所述ciita基因的敲除同时进行，用于进行所述敲除的组分按比例在20μl体系中包括：

46、30pmol的cas9和45pmol的靶向seq id no：7所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

47、25pmol的cas9和40pmol的靶向seq id no：9所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

48、25pmol的cas9和40pmol的靶向seq id no：11所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

49、80pmol的cas9和150pmol的靶向seq id no：13所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；

50、40pmol的cas9和120pmol的靶向seq id no：20所示序列的sgrna所形成的rnp复合物；以及

51、50pmol的cas9和80pmol的靶向seq id no：25所示序列的sgrna所形成的rnp复合物。

52、另一方面，本文提供了制备通用嵌合抗原受体t细胞(ucar-t)的方法，包括：

53、1)利用使用胞嘧啶碱基编辑器制备如下基因被敲除的t细胞：

54、i)trac基因和/或trbc基因；

55、ii)cd5基因；

56、iii)cd7基因；以及

57、2)以包括嵌合抗原受体(car)的编码序列的核酸分子转染所述t细胞，使其表达嵌合抗原受体(car)。

58、在一些实施方案中，在步骤1)中还包括敲除所述t细胞的b2m基因。

59、在一些实施方案中，在步骤1)中还包括敲除所述t细胞的ciita基因。

60、在一些实施方案中，对所述trac基因的敲除所使用的sgrna的靶序列为seq idno：26所示序列。

61、在一些实施方案中，对所述trbc基因的敲除所使用的sgrna的靶序列选自seq idno：27-31任一项所示序列及其任意组合。

62、在一些实施方案中，对所述b2m基因的敲除所使用的sgrna的靶序列选自seq idno：33和34所示序列及其组合。

63、在一些实施方案中，对所述b2m基因的敲除使用两种sgrna，其中所述两种sgrna的靶序列分别为seq id no：8和9所示序列。

64、在一些实施方案中，用于敲除所述cd5基因的sgrna的靶序列选自seq id no：37、39、41-46任一项所示序列及其任意组合。

65、在一些实施方案中，用于所述cd7基因敲除的sgrna的靶序列为seq id no：47所示序列。

66、在一些实施方案中，用于所述ciita基因敲除的sgrna的靶序列选自seq id no：50、51、54、57任一项所示序列及其任意组合。

67、在一些实施方案中，所述胞嘧啶碱基编辑器为ncbe3或ncbe4蛋白。

68、在一些实施方案中，在以cd2/cd3/cd28抗原激活所述t细胞之前对所述trac基因、所述b2m基因、所述cd5基因、所述cd7基因和/或所述ciita基因进行敲除。

69、在一些实施方案中，所述car的胞外抗原结合结构域包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分能够特异性结合cd7，所述第二抗原结合部分能够特异性结合cd5。

70、在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包括来自抗cd7单域抗体的重链可变区，所述重链可变区的hcdr1包括seq id no：59所示氨基酸序列、hcdr2包括seq id no：60所示氨基酸序列以及hcdr3包括seq id no：61所示氨基酸序列。

71、在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分包括来自抗cd5单域抗体的重链可变区，所述重链可变区的hcdr1包括seq id no：63所示氨基酸序列、hcdr2包括seq id no：64所示氨基酸序列以及hcdr3包括seq id no：65所示氨基酸序列。

72、在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包括seq id no：62所示氨基酸序列。

73、在一些实施方案中，所述第二抗原结合部分包括seq id no：66所示氨基酸序列。

74、在一些实施方案中，所述car的胞外抗原结合结构域包括seq id no：74所示氨基酸序列。

75、在一些实施方案中，所述car从氨基端到羧基端依次包括所述第一抗原结合部分、连接片段、所述第二抗原结合部分、铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域和胞内信号传导结构域。

76、在一些实施方案中，所述连接片段包括seq id no：67所示氨基酸序列；所述铰链区包括seq id no：68所示氨基酸序列；所述跨膜区包括seq id no：69所示氨基酸序列；所述胞内共刺激结构域包括seq id no：70所示氨基酸序列；所述胞内信号传导结构域包括seq id no：71所示氨基酸序列。

77、在一些实施方案中，所述核酸分子中还包括tegfr或单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)的编码序列。

78、在一些实施方案中，所述核酸分子中的所述tegfr或hsv-tk的编码序列的通过自剪切肽的编码序列连接在所述car的编码序列的下游。

79、在一些实施方案中，所述自剪切肽为t2a，其氨基酸序列优选为seq id no：72所示。

80、在一些实施方案中，还包括在步骤2)后筛选出不表达tcr和mhc-i类分子的t细胞。

81、在一些实施方案中，所述t细胞含有nkt细胞，例如10-20％数量比例的nkt细胞。

82、另一方面，本文提供了通过上述方法制备的ucar-t细胞。

83、另一方面，本文提供了药物组合物，其包括上述ucar-t细胞和药学上可接受的载体。

84、另一方面，本文提供了上述ucar-t细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

85、在一些实施方案中，所述癌症在其细胞表面表达cd5和/或cd7。

86、在一些实施方案中，所述癌症为t细胞恶性肿瘤，如急性t淋巴细胞白血病(t-all)和t细胞淋巴瘤。

87、另一方面，本文提供了在受试者中治疗癌症的方法，包括以治疗有效量的上述ucar-t细胞或药物组合物向所述受试者给药。

88、在一些实施方案中，所述癌症在其细胞表面表达cd5和/或cd7。

89、在一些实施方案中，所述癌症为t细胞恶性肿瘤，如急性t淋巴细胞白血病和t细胞淋巴瘤。

90、在一些实施方案中，所述方法还包括治疗后以更昔洛韦(gcv)向所述受试者给药。

91、另一方面，本文提供了药物试剂盒，包括：1)上述ucar-t细胞或药物组合物；以及2)gcv。