一种分泌型重组人生长激素工程菌高密度发酵工艺的制作方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种分泌型重组人生长激素工程菌高密度发酵工艺。


背景技术：

2.人生长激素(rhgh)是人内源性激素，是脑垂体前叶分泌的一种蛋白类激素，含有191个氨基酸，分子量为22kd。重组人生长激素(rhgh)是利用基因工程方法将人类生长激素基因从染色体dna链上分离出来，重组到质粒上，并用不同的表达体系表达的重组蛋白。rhgh的氨基酸含量、空间构象及序列与人生长激素完全相同，具有与人体内源性生长激素等同的生物学作用。临床上主要应用千治疗或缓解因生长激素(gh)分泌不足或缺乏而导致的儿童矮小症、组织修复、烧烫伤、成人生长激素缺乏(ghd)等。
3.目前人生长激素已经分别在大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞中获得成功表达，但现有技术的重组人生长激素发酵工艺目前还不十分成熟，产量低、生产成本高，无法满足临床的大量需求。
4.大肠杆菌是用于表达异源蛋白最常用的宿主。大肠杆菌的高密度发酵技术还不成熟。据文献报道的两个最高菌密度分别为174g(dcw)/l和175.5g(dcw)/l，而利用批式发酵技术所达到的菌密度不到10g(dcw)/l。当然不同的菌株，其间应存在着差别。据文献报道，人生长激素的融合蛋白胞内表达可达1.08g/l，但这种蛋白的氮端多了几个氨基酸，需要进行体外剪切。另据报道，以包涵体形式表达的人生长激素可达1.75g/l，其氮端比天然生长激素多了一个蛋氨酸。


技术实现要素：

5.有鉴于此，为解决以上不足，本发明提供一种分泌型重组人生长激素工程菌的发酵工艺，可提高重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高发酵设备和原料的利用率。
6.一种分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵工艺，所述发酵工艺如下：
7.s1菌种摇瓶培养：采用lb培养基为基础，接入构建基因工程菌进行菌种培养，一级接种量为1：250，二级接种量为1：190，获得液体发酵菌种；
8.s2配制发酵罐内培养基：磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钠0.5％，氯化钾，硫酸镁0.3％等，微量元素0.02％，酸水解酪蛋白0.5％，酵母提取物0.5％，补料流加50％葡萄糖和酪素；
9.s3发酵：将上述所得发酵培养基灭菌之后，接入所得液体发酵菌种，发酵培养温度37度，ph值7.0，溶解氧100％；进入对数生长期后，通过调节空气流量和搅拌转速控制溶氧浓度至少为20％，当od600达到30左右时，通入医用氧确保溶解氧始终保持在20％以上，当ph值降至7.0时候；通过流加25％(v/v)氨水使得ph值维持在7.0；当od600达到65左右时，流加50％葡糖糖量此时达到最大值，当od600达到90左右时，流加50％葡萄糖为最大值的一半左右；当od600稳定在95左右，稳定期为8h左右，可以放罐收集菌体；
10.s4收集菌体：将发酵液接入管式离心机16000rpm，得到菌体，存放于-80度储存，破碎后分离纯化得到目标蛋白。
11.优选的是，所述lb培养基包括以下重量计成分：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，配制2000ml菌种培养基。
12.优选的是，所述s1中微量元素为fe、zn、mn、cu、co、ca。
13.优选的是，所述s1中所述酪素为酸水解酪蛋白0.25％、酶水解蛋白0.75％、酵母提取物0.5％。
14.与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
15.1、本发明提供一种分泌型重组人生长激素工程菌的发酵工艺，该工艺通过发酵温度、ph和po等参数调整进而控制工艺优化，提高重组人生长激素工程菌的蛋白表达，提高发酵设备和原料的利用率；
16.2、本发明采用碱性磷酸酶启动子，发酵培养基采用磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钠0.5％的比例，磷酸盐过量hgh无表达，磷酸盐不足，达不到高密度发酵。
附图说明
17.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
18.图1为工程菌高密度发酵生产曲线图。
19.图2为图1中最高点(od值)的蛋白高电泳图。
20.图2中：1全菌体电泳；2裂解液电泳；3盐析液电泳；4、5、6、7均为标准品电泳。
具体实施方式
21.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
23.一种分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵工艺，所述发酵工艺如下：
24.s1菌种摇瓶培养：采用lb培养基，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，配制2000ml菌种培养基，接入构建基因工程菌进行菌种培养，一级接种量为1：250，二级接种量为1：190，获得液体发酵菌种，具体为：本研究主要运用大肠杆菌w3110，用表达质粒转化w3110大肠杆菌菌株得到的工程菌，命名为ps-hgh，对人生长激素进行胞间质可溶性表达，其一级结构与天然蛋白完全一致，且直接分泌到细胞周质中，有利于提纯，并通过大量优化工程菌的培养条件，实现了工程菌的稳定培养和高水平表达，实现了重组人生长激素(rhgh)的大规模生产。
25.s2配制发酵罐内培养基：磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钠0.5％，氯化钾，硫酸镁0.3％等，微量元素(fe、zn、mn、cu、co、ca)0.02％，酸水解酪蛋白0.5％，酵母提取物0.5％，补料流加50％葡萄糖和酪素(酸水解酪蛋白0.25％，酶水解蛋白0.75％，酵母提取物
0.5％)。
26.s3发酵：将上述所得发酵培养基灭菌之后，接入所得液体发酵菌种，发酵培养温度37度，ph值7.0，溶解氧100％；进入对数生长期后，通过调节空气流量和搅拌转速控制溶氧浓度至少在20％以上，当od600达到30左右时，比生长速率达到最大，空气流量和搅拌转速均达到最大值，溶解氧供应不足，此时通入医用氧(14.5mpa)确保溶解氧始终保持在20％以上，当ph值降至7.0时候，通过流加25％(v/v)氨水使得ph值维持在7.0。当od600达到65左右时，流加50％葡糖糖量此时达到最大值，此时发酵培养基中磷酸盐含量基本耗尽，细菌不在进行分裂繁殖，碱性磷酸酶启动子开始启动，目的蛋白开始表达，为确保因葡糖糖流加过量而形成乙酸积累影响目的蛋白表达，此刻开始调控50％葡萄糖流加量逐渐减少；当od600达到90左右时，流加50％葡萄糖为最大值的一半左右，维持该速率恒定不变，当od600稳定在95左右，稳定期(培养时间)为8h左右，可以放罐收集菌体。
27.s4收集菌体：将发酵液接入管式离心机16000rpm，得到菌体，存放于-80度储存，破碎后分离纯化得到目标蛋白。
28.目的蛋白表达含量的计算：用渗透压休克法。提取1.0ml发酵液细菌周质总蛋白，用lowrry定氮法计算总蛋白。并根据sds-page扫描结果目的蛋白所占百分比计算目的蛋白含量。
29.实施例1
30.i代菌种制备
31.接种前，向预先准备好的(灭菌条件为121℃，30min)装量为50ml lb的250ml三角瓶中，加入浓度为5mg/ml四环素溶液，使四环素终浓度为5μg/ml。然后取1支甘油管菌种，室温融化，轻微混匀，将此菌种按1：250接入，振荡培养。
32.培养温度37℃，摇床转数220rpm，od600控制在2.0
±
0.2，培养时间以控制od值为准，一般为5小时左右根据具体情况可调整。
33.ii代菌种制备
34.接种前，向预先准备好的(灭菌条件为121℃，30min)装量为950ml lb的2000ml三角瓶中，加入浓度为5mg/ml四环素溶液，使四环素终浓度为5μg/ml。然后取i代菌种5ml按1：190接入，振荡培养。每次制备2瓶，振荡培养。
35.培养温度37℃，摇床转数220rpm，od600控制在2.2
±
0.2，培养时间以控制od值为准，一般为5小时左右根据具体情况可调整。
36.iii代种子制备
37.iii代种子培养基：13l，121℃，30min灭菌，降温至37℃。接种前加入浓度为5mg/ml四环素溶液使抗生素终浓度为5μg/ml
38.iii代种子补料葡萄糖：0.5l(50％)，115℃，30min灭菌，备用。
39.iii代种子培养参数：接种量：1900ml
40.温度：37
±
0.5℃，pid自动控制
41.ph控制范围，7.0
±
0.1，pid自动调节
42.溶氧控制要求，空气流量设定100l/min，pid自动调节
43.培养开始搅拌转数设定300rpm，当po2每低于40％，增加50rpm，直至800rpm。当po2低于30％，一次性增加罐压0.2bar，po2继续下降低于30％，提高罐压至0.4bar，并保持不
变。
44.培养时间：约6小时，
45.转种od：14.5
±
0.5。
46.菌体形态：均一短杆且没有杂菌
47.转种压力：0.8bar
48.发酵培养
49.发酵罐内培养基：303l，121℃，30min灭菌，降温至37℃。
50.补料葡萄糖：55l(50％)，115℃，30min灭菌，降温至37℃备用。
51.补料酪素：47l，121℃，30min灭菌，降温至37℃备用。
52.接种量：15l
53.氨水补料：5l
54.总培养基数量：425l：
55.温度：37
±
0.5℃，pid自动控制
56.ph：7.0
±
0.1(拐点除外)，pid自动调节
57.po2：将上述所得发酵培养基灭菌之后，发酵转种前调节空气流量：800l/min；搅拌转数100rpm；罐压：0.4bar，溶解氧100％，发酵培养温度37度，ph值7.0。接入所得液体发酵菌种，开始流加50％葡萄糖，初始流速为0，流速增加值δ＝0.12ml/min，培养4h左右，流速为28.8ml/min，此时od600达到26左右时，比生长速率达到最大，，此时流速增加值调整为δ＝0.2ml/min，搅拌转速亦达到最大值，溶解氧供应不足，此时通入医用氧(14.5mpa)确保溶解氧始终保持在20％以上，当培养时间为8h，此时od600达到70左右，流加50％葡糖糖量亦达到80ml/min，此时发酵培养基中磷酸盐含量基本耗尽，细菌不在进行分裂繁殖，碱性磷酸酶启动子开始启动，目的蛋白开始表达，为确保因葡糖糖流加过量而形成乙酸积累影响目的蛋白表达，此刻开始调控50％葡萄糖流加量逐渐减少δ＝0.3ml/min；当od600达到90左右时，流加50％葡萄糖为最大值的一半左右约44ml/min，维持该速率恒定不变，继续培养6h后，可以放罐收集菌体，上述葡萄糖流加数据均按照设计流速输入计算机控制系统，自动控制。
58.酪素流加：发酵2.5h，od600在10左右时，开始酪素流加，流速增加值为δ＝0.3ml/min，当流加1.5h左右，流速达到18ml/min，比生长速率达到最大值，此时调整流速增加值δ＝0.5ml/min，当培养时间达到8h，此时流速为120ml/min，此时发酵培养基中磷酸盐含量基本耗尽，细菌不在进行分裂繁殖，碱性磷酸酶启动子开始启动，目的蛋白开始表达，此时开始减少酪素流加量，δ＝0.5ml/min，当流速降至50ml/min，维持该流速恒定不变，直至放罐收集菌体。上述酪素流加数据均按照设计流速输入发酵罐计算机控制系统，自动控制。
59.培养时间：16小时，
60.放罐集菌
61.离心机转数：16000转/分钟；
62.离心时间：30分钟；
63.放罐流速：2升/分钟；
64.发酵结束收获菌体总重量为：42.5
±
0.5kg。
65.目的蛋白表达含量的计算：用渗透压休克法。提取1.0ml发酵液细菌周质总蛋白，
用lowrry定氮法计算总蛋白。并根据sds-page扫描结果目的蛋白所占百分比计算目的蛋白含量。
66.如图1所示本发明工艺具有高密度发酵，发酵od600达到95，目的蛋白高表达特点。如图2所示，电泳扫描结果：全菌体中rhgh占总蛋白的14.47％，裂解液中rhgh占总蛋白的42.49％，盐析液中rhgh占总蛋白的48.83％。
67.高密度发酵的主要障碍之一是代谢副产物乙酸的积累。利用工程菌表达多肽药物，培养条件对重组蛋白的表达有显著影响，如培养基的组成、供氧水平、补料或稀释速率等的改变都会通过改变细菌的能量代谢和小分子前体(如氨基酸、核苷酸等)的供应，影响生物大分子的合成和细菌的生长。在细菌的合成代谢和能量代谢过程中，会产生一些代谢副产物，如乙酸，会严重影响细菌的生长和产物的生成。大肠杆菌利用葡萄糖供能时会产生乙酸，随着细菌密度的升高，乙酸积累达到一定程度后，会造成生长和产物合成的停止。乙酸的生成取决于所用的培养基及比生长速率，过量的葡萄糖会导致乙酸的产生。
68.由于发酵过程是一个动态的过程，因此葡萄糖应根据消耗的速度加入，防止乙酸的积累，但同时又不能让细胞饥饿。细菌利用葡萄糖代谢，其浓度过高时便会产酸，使培养基ph值下降，溶解氧也会迅速下降；当其浓度过低时，细菌就会利用氮源中的碳作为碳源供能，此时细菌就会分泌氨离子，使培养基ph值上升，溶解氧上升。鉴于这一原理，本研究采用补料批式发酵方式，通过ph和po2反馈控制流加葡萄糖，获得较好的结果。
69.从批式发酵和补料批式发酵两种补料方式来探讨其对细菌生长和表达的影响，可以看出差别较显著。在批式发酵前期由于葡萄糖的浓度高，产生大量乙酸，而后期则存在葡萄糖不足的问题。在补料批式发酵过程中，葡萄糖逐渐加入发酵罐中的，可以避免由葡萄糖生成代谢抑制产物乙酸。由于细菌的生长是以近似指数形式增加，因此它对葡萄糖的需求也以这种形式增加。在恒速补料过程中，不能很好地满足细菌对葡萄糖的需求，而在逐渐增加的补料方式中，葡萄糖的补加和细菌的需求能较好地吻合，本发明采用补料批式发酵工艺，并对发酵工艺涉及的参数进行大量研究。
70.本发明选用碱性磷酸盐启动子(phoa)，在细菌生长过程中，磷酸盐未耗尽，hgh基本没有达。在细菌达到较高密度之后，磷酸盐耗尽时，细菌基本不再分裂，此时应降低葡萄糖的补加速度，葡萄糖的补加只需满足细菌的能量代谢，总时间为21h是比较合适的，本发明采用碱性磷酸酶启动子，发酵培养基采用磷酸氢二钠0.1％，磷酸二氢钠0.5％的比例，磷酸盐过量hgh无表达，磷酸盐不足，达不到高密度发酵。
71.进一步，本发明采用在发酵对数生长期，采用通入医用氧，增加了发酵密度和生长激素的得率。采用医用氧，不存在因通入压缩空气产生的液沫夹带，发酵罐容积利用率由70％变为85％，提升了发酵罐利用率。
72.如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本技术的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本技术的一般原则为目的，并非用以限定本技术的范围。本技术的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
73.上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改
和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。