一种抗NT-proBNP的结合蛋白的制作方法

本发明涉及生物技术和医学，尤其是涉及一种包含nt-probnp抗原结合结构域的分离的结合蛋白及其应用。

背景技术：

1、1988年日本学者sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强有力的利尿、扩血管和降压作用的多肽，将其命名为脑钠肽(brain natriuretic peptide，bnp)。bnp分布在心脏含量最高，但心肌细胞首先合成的是含有108个氨基酸的probnp(bnp前体)，当心肌细胞受到刺激后，probnp在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的n末端b型利钠肽原(nt-probnp)和含有32个氨基酸、具有活性的b型利钠肽(bnp)，两者来源相同并且等摩尔分泌释放进入血循环。

2、当心脏容量负荷增加或心脏功能受损时，n末端脑钠肽前体(nt-probnp)与bnp的指标浓度会异常升高，其中nt-probnp相对bnp生物稳定性较好，半衰期较长(120min),浓度相对较稳定,有效检测时间长,血液中含量相对比bnp高约16～20倍,因此检测相对容易,并且血浆标本在体外的稳定性长(>48h),是诊断心力衰竭和评价心脏功能的最佳心肌标志物。

3、正常的人血液中nt-probnp含量一般低于0.3ng/ml。当心脏功能受损，心肌扩张时，nt-probnp会快速合成并大量分泌释放进入到人体血液中。在发现一些相关早期病症的时候，准确、灵敏、高效稳定地测定血液中nt-probnp的量，能给早期心功能不全、心衰、呼吸困难的心源性及非心源性心衰治疗及预后监测、急性冠状动脉综合征的分级等方面提供快速、准确的早期诊断依据。目前用于检nt-probnp含量的方法主要有金标定性试验、荧光免疫法、酶联免疫吸附试验(elisa)和磁微粒化学发光法(cmia)，但是这些测量方法都需要针对于nt-probnp的特异性单克隆抗体。

4、目前针对nt-probnp的单克隆抗体来源少，只能依靠进口价格贵，灵敏度、亲和力以及特异性都存在缺陷。

技术实现思路

1、本发明涉及一种包含nt-probnp抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对其进行制备、应用等方面的研究。

2、所述抗原结合结构域包括以下互补决定区之一；

3、互补决定区cdr-vh1为seq id no.1所示的氨基酸序列；

4、互补决定区cdr-vh2为seq id no.2所示的氨基酸序列；

5、互补决定区cdr-vh3为seq id no.3所示的氨基酸序列；

6、互补决定区cdr-vl1为seq id no.4所示的氨基酸序列；

7、互补决定区cdr-vl2为seq id no.5所示的氨基酸序列；

8、互补决定区cdr-vl3为seq id no.6所示的氨基酸序列。

9、在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个cdrs；或者，所述结合蛋白包括至少6个cdrs。

10、在一些实施方式中，本技术所述结合蛋白可以包含3个cdrs、4个cdrs、5个cdrs、6个cdrs，可选的，所述cdrs可以是选自重链cdr区域和/或轻链cdr区域的任意组合。

11、在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体、双链抗体、单链抗体、纳米抗体、f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

12、在一些实施方式中，所述的结合蛋白，包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区序列如seq id no.7所示；所述轻链可变区序列如seq id no.9、seq id no.11、seq id no.12或seq id no.13所示。

13、在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

14、在一些实施方式中，所述恒定区序列选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd任何其中之一恒定区的序列。

15、在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

16、在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠。

17、在另一些实施方式中，本发明的恒定区可以来源于人，以构成人源化的抗体。

18、在一些实施方式中，所述

19、重链恒定区序列如seq id no:14所示；

20、轻链恒定区序列如seq id no:15所示。

21、在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。

22、本发明还提供一种核酸分子，所述所述核酸分子为dna或rna，其编码上述的结合蛋白。

23、本发明还提供了一种载体，其包含上述的核酸分子。

24、本发明还提供了一种宿主细胞，其包含上述核酸分子或上述载体。

25、在一些实施方式中，所述的宿主细胞包括细菌、真核细胞、酵母和杆状病毒系统。

26、在一些实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞，进一步的为哺乳动物细胞。

27、在一些实施方式中，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、幼仑鼠肾细胞或小鼠骨髓瘤细胞。

28、在一些实施方式中，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细胞。

29、本发明还提供了一种生产上述结合蛋白的方法，包括如下步骤：

30、在培养基中培养上述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的结合蛋白。

31、根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂或试剂盒，其包含上述结合蛋白。

32、在一些实施方案中，所述试剂或试剂盒还包含缓冲剂、稳定剂、稀释剂或载体中的一种或多种。

33、在一些实施方案中，本发明提供用于检测心力衰竭或心脏功能评价受试者中的nt-probnp蛋白存在的试剂盒。

34、根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中的nt-probnp的方法，其包括：

35、a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的nt-probnp抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

36、b)检测所述免疫复合物的存在。

37、在一些实施方案中，步骤a)所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；

38、在一些实施方案中在步骤a)所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述nt-probn抗原结合。

39、在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合nt-probnp的不同抗原表位。

40、在一些实施方案中，所述结合蛋白可以标记有显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

41、在一些实施方案中，所述的第二抗体可以标记有显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

42、在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂选自荧光标记、酶、金属离子、同位素或荧光微球。

43、在一些实施方案中，本发明还提供了上述的结合蛋白在制备用于检测心力衰竭或评价心脏功能的产品中的应用。

44、本发明所提供的nt-probnp结合蛋白活性强，与人nt-probnp具有很高的亲和力，且与市面上常见的nt-probnp抗体相比，具有较优的灵敏度和特异性，能够实现对nt-probnp的高效检测，从而为心力衰竭和心血管疾病的早期诊断提供依据。