一种枯草芽孢杆菌小RNA调控系统构建方法

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌小rna调控系统构建方法，属于生物工程。

背景技术：

1、枯草芽孢杆菌由于其遗传背景清晰、分泌能力优越及培养条件简单等优势被认为是下一 代超高效分泌的细胞工厂。非编码小rna(srna)是枯草芽孢杆菌中重要的转录后调节因 子，能够调节其对应靶向基因的表达水平。在多数情况下，srna都利用其序列特异性与靶 rna结合使之发生构象变化抑制或激活mrna翻译，或通过碱基配对形成存在rnase作用 位点促进靶rna的降解，从而在后转录水平对基因表达进行调控。

2、在模式微生物枯草芽孢杆菌中研究较为透彻的srna系统是i型的毒素-抗毒素(ta)系 统，ta系统通常包括一种过表达能导致细胞生长停滞或死亡、性质稳定的毒素，以及能抵消 毒素作用、性质不稳定的抗毒素。具体机制有1.毒素mrna与抗毒素mrna在3’端存在配 对区域，两者配对后形成核酸内切酶作用位点后被若干rnase降解；2.配对区域在毒素mrna 的5’端时，可通过碱基配对遮蔽毒素mrna的rbs阻止其翻译。利用上述机制人为改造i型 ta系统为靶向任何基因的srna。

3、yont-yoyj/sr6是来源于b.subtilis 168基因组源噬菌体spβ的i型毒素-抗毒素系统，其 抗毒素trans-acting srna sr6约为100nt，并且其5'端能与毒素蛋白基因yoyj的mrna的5' 端互补配对形成双链区，进而引起yoyj mrna的翻译阻遏，从而实现毒素蛋白表达抑制，使 宿主细胞的生长不受影响。

4、基因表达的各个阶段都有相应的基因表达调控工具。在转录水平进行调控的主要工具有： 启动子，通过更换靶基因上游组成型启动子来实现对目的蛋白的不同强度表达，也可以使用 诱导型启动子并通过诱导物来改变基因的表达强度，但缺点在于需要对基因组上靶基因周围 的序列进行改造，操作复杂；crispr-dcas9，dcas9通过guide rna定位到靶序列可以阻碍 基因的转录，或通过设计dcas9与转录激活因子结合并募集rna聚合酶(rna polymerase， rnap)，促进基因转录，但缺点在于需要额外表达具有一定毒性的dcas9蛋白对细胞的生长 带来负担；核糖开关，核糖开关由适体(aptamer)和表达平台(expression platform)两部分 组成。适体可以与特定的配体结合引起mrna二级结构变化，从而影响下游基因的转录，缺 点在于仍需要对基因组上靶基因附近的序列进行改造，操作复杂。在转录后水平进行调控的 工具往往是通过srna实现的，但在枯草芽孢杆菌中天然改造的srna调控工具如ms- dos(参考论文：yang s,wang y,wei c,et al.a new srna-mediated posttranscriptional regulation system for bacillussubtilis.biotechnol bioeng.2018；115(12):2986-2995.doi:10.1002/bit.26833)， 则是通过在基因组上目的基因终止密码子后插入opr序列后与srna配对实现目的基因 mrna的降解，缺点扔在于仍需要对基因组上靶基因附近的序列进行改造，操作复杂。

技术实现思路

1、本发明从枯草芽孢杆菌内源ta系统中yoyj/sr6出发，提出了快速构建枯草芽孢杆菌小 rna调控元件的方法。

2、为了快速构建大量靶向枯草芽孢杆菌内源目的基因的抑制元件，从sr6的结构出发，依 据以下规则设计小rna序列：人工控制设计茎长为8bp和11bp，环长为4nt，总体自由能 大于-15kcal/mol的hairpin结构，再于其3’末端添加9个polyu，即构成一个具有基因调控 功能的非编码srna。然后，将需要调控的目的基因起始密码子及其后21nt的反向互补序列 连接到srna的5’端，并将该srna组装在枯草芽孢杆菌表达载体上，转化至枯草芽孢杆菌中实现对目的基因的表达调控。

3、本发明无需额外表达其他蛋白辅助srna发挥功能，也无需额外对靶基因进行改造，只 需转入质粒即可实现的对靶基因快速方便的抑制。

4、本发明的第一个目的是提供一种靶向枯草芽孢杆菌内源或外源基因的非编码srna，所 述非编码srna由长度为24nt的靶向基因互补序列、发卡结构及9个polyu组成；所述发卡 结构的茎长为8bp或11bp，环长为4nt，总体自由能大于-15kcal/mol。

5、在一种实施方式中，所述非编码基因的srna的发卡结构及9个polyu的区域分别如seq id no.1～5、seq id no.7～14中的非靶向基因互补序列区域所示。

6、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为bacillus subtilis sck。

7、在一种实施方式中，所述内源基因包括枯草芽孢杆菌基因组上的基因；所述外源基因包 括可在枯草芽孢杆菌中表达的任一非枯草芽孢杆菌来源的基因。

8、在一种实施方式中，所述内源基因包括ftsz、comer、acoa、bdha、aslr、asld、ldh、pta。

9、在一种实施方式中，所述外源基因包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等 可在枯草芽孢杆菌中表达的外源基因。

10、本发明的第二个目的是提供了一种抑制绿色荧光蛋白表达的方法，所述方法是在表达绿 色荧光蛋白的重组枯草芽孢杆菌中，转入含有序列seq id no.3～5任一所示的非编码srna 的重组表达载体。

11、在一种实施方式中，所述重组表达载体为p43nmk，利用p43启动所述非编码srna的表达。

12、本发明的第三个目的是提供一种抑制枯草芽孢杆菌内源基因表达的方法，所述方法是利 用所述的非编码srna抑制内源基因的表达。

13、在一种实施方式中，所述内源基因包括ftsz、comer、acoa、bdha、aslr、asld、ldh、pta。

14、在一种实施方式中，将seq id no.7～14所示的非编码srna序列连接至表达载体p43nmk上，利用启动子p43启动非编码srna的表达，构建得到重组表达载体。

15、在一种实施方式中，将重组表达载体转入枯草芽孢杆菌中构建得到重组枯草芽孢杆菌， 将重组枯草芽孢杆菌在30～40℃培养30～50h。

16、优选地，所述枯草芽孢杆菌为bacillus subtilis sck。

17、本发明的第四个目的是提供一种提高乙偶姻产量的方法，所述方法是在枯草芽孢杆菌中 表达含有与乙偶姻代谢相关的基因的靶向序列的非编码srna。

18、在一种实施方式中，所述与乙偶姻代谢相关的基因包括asld、ldh、pta、acoa、bdha。

19、在一种实施方式中，在枯草芽孢杆菌中表达seq id no.10～14任一所示的非编码srna。

20、在一种实施方式中，将所述枯草芽孢杆菌以初始od600＝0.1～0.5在发酵培养基中培养。

21、在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有8～12g/l酵母提取物，5～6g/l胰蛋白胨， 5～6g/l(nh4)2so4，10～15g/l k2hpo4·3h2o，1～5g/l kh2po4，1～5g/l mgso4，10～30g/l葡 萄糖，5～15ml/l微量元素。

22、在一种实施方式中，所述在37℃下培养48h。

23、本发明的有益效果：

24、本发明可以快速设计产生大量srna调控工具对枯草芽孢杆菌中的基因表达进行敲低。 与其他调控方法相比，本发明无需额外表达其他rna伴侣蛋白等其他基因，也无需对目的基 因进行改造，操作简便、高效。其次，本发明可快速设计出大量序列不同的人工srna调控 工具，丰富了调控元件库的种类和数量。利用本发明的srna可实现对外源基因gfp、内源基 因ftsz、comer、aslr、asld、ldh、pta、acoa、bdha等实现不同程度的抑制，可有效调控目 的基因的表达。