环介导等温扩增引物组及其应用

本发明属于细菌检测，具体涉及一种环介导等温扩增引物组及其应用，该环介导等温扩增引物组用于检测布鲁氏菌。

背景技术：

1、布鲁氏菌病由布鲁氏菌属导致的动物疫病，主要累及家畜，人是偶然宿主，换言之，布鲁氏菌病是一种人蓄共患病，是中华人民共和国传染病防治法规定的乙类传染病，俗称“蔫巴病”、“懒汉病”。布鲁氏菌是一个比较小的革兰氏阴性杆菌，大约宽在0.5μm-0.7μm，长是0.5μm-1.5μm。布鲁氏菌也分为很多种种型，全世界大部分要分7个种，19个型。目前现在发现的越来越多，已经有8个种20多个型，其中最常见的主要有4种：牛种布鲁氏菌(b.abortus)、羊种布鲁氏菌(b.melitensis)、猪种布鲁氏菌(b.suis)和犬种布鲁氏菌(b.canis)。布鲁氏菌在自然界存在的能力非常的强大，在水里面可以存活5d至4个月。日常生活中喝的鲜奶里面，布鲁氏菌可以存活2d到18个月。布鲁氏菌是革兰氏阴性胞内菌，无鞭毛，不形成荚膜和芽孢，所以在紫外下或者在100℃以上，一般在做了30秒或者是一分钟，就能够把布鲁氏菌进行杀灭，在日常生活中，用一般的消毒水，例如0.1％新洁尔灭或者0.2％-2.5％漂白粉和75％酒精，都能够把布鲁氏菌杀灭。

2、由于布鲁氏菌病的病原的种类繁多，所以布鲁氏菌病的传播途径也相对比较多，感染的动物面积也比较广，感染布鲁氏菌的家畜是主要的传染源，目前已知60多种动物可以作为布鲁氏菌贮存的宿主。猪牛羊作为传染源是最常见的，其中羊是人类布鲁氏菌病的最主要的传染源，传播途径主要有直接接触传播、消化道传播、呼吸道传播三种：直接接触传播：直接接触病畜或病畜的排泄物、或者在饲养、屠宰和加工等过程中经皮肤或者眼结膜感染；消化道传播：主要是通过食用被布鲁氏菌污染的食品、水或者饮用生奶以及没有煮熟的肉、内脏等感染；呼吸道传播：常见于吸入被布鲁氏菌污染的飞沫、尘埃；易感人群：过去感染者主要是职业人群，也就是跟牛羊养殖生产密切接触的人员，例如牛羊饲养人员、屠宰加工人员、兽医和检疫员等，这些人员的感染概率最高。这些年随着人们的消费模式、生活方式的改变，布鲁氏菌病患者的分布范围越来越广，除了农牧区从业人群外，城区人群感染风险有增加趋势。家畜感染布鲁氏菌后的潜伏期大约14d到180d，怀孕的母畜会出现流产，还会引起子宫内膜炎等，即使胎儿没有流产，也会出现败血症以及出血、发炎等毛病，而公畜常常发生睾丸炎、附睾炎和关节炎等毛病。人感染布鲁氏菌后会引起多系统、多器官的危害，急性症状为发热(即波浪热，在一定的时间忽然发热，但是过一段时间以后又消失，再在一定的时间同时又出现了发热，反复发作)、无力、多汗、肌肉关节疼痛、肝脏、淋巴结肿大；慢性症状为关节损伤和长期发热。

3、布鲁氏菌病的诊断技术有细菌学诊断(细菌分离鉴定)但是一般初代分离需1周-2周，有时可达40多天，布鲁氏菌生长比较慢，操作方法以及病原样本选取会导致检测布鲁氏菌的阳性率低，分离技术操作复杂，鉴定的周期比较长，不能及时诊断是否被感染，而且布鲁氏菌的感染风险以及对实验条件要求高，需在p2级以上实验室进行操作，这就造成了许多的局限，因而不便于推广。免疫学诊断：检测布鲁氏菌常用的免疫学方法有虎红平板凝集试验(rbpt)、试管凝集试验(sat)、补体结合试验(cft)、酶联免疫吸附试验(elisa)。其中酶联免疫吸附试验(elisa)又分为间接法、直接法、双抗体夹心法、竞争法。凝集试验与补体结合试验均存在非特异性反应、假阳性等不足；pcr检测与elisa检测等方法虽敏感性高、特异性强，但需要特殊仪器和实验室环境。

4、综上，以上方法不能满足对布鲁氏菌的快速检测，亟需一种能快速检测，且简单的布鲁氏菌的检测方法。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种环介导等温扩增引物组，该引物组可以使用环介导等温扩增方法对布鲁氏菌进行特异性扩增，且灵敏度高。

2、为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：

3、本发明一方面提供了一种环介导等温扩增引物组，其包括如seq id no.1所示的f3引物、如seq id no.2所示的b3引物、如seq id no.3所示的fip引物和如seq id no.4所示的bip引物。

4、本发明另一方面提供了一种检测试剂，其包括上述的环介导等温扩增引物组。

5、本发明再一方面提供了一种检测试剂盒，其包括上述的环介导等温扩增引物组或上述的检测试剂。

6、本发明再一方面提供了一种上述的环介导等温扩增引物组或上述的检测试剂或上述的检测试剂盒在检测布鲁氏菌中的应用。

7、本发明再一方面提供了一种利用环介导等温扩增检测布鲁氏菌的方法，其包括使用上述的环介导等温扩增引物组进行扩增检测。

8、本发明有益效果至少包括：本发明提供的环介导等温扩增引物组可以对布鲁氏菌进行特异性扩增，从而快速高效检测布鲁氏菌，而且检测限在1x104cfu/ml-1x105cfu/ml之间，灵敏度高。

技术特征：

1.环介导等温扩增引物组，其特征在于，包括如seq id no.1所示的f3引物、如seq idno.2所示的b3引物、如seq id no.3所示的fip引物和如seq id no.4所示的bip引物。

2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增引物组，其特征在于，还包括如seq id no.5所示的loopf引物和如seq id no.6所示的loopb引物。

3.检测试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的环介导等温扩增引物组。

4.检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的环介导等温扩增引物组或权利要求3所述的检测试剂。

5.权利要求1或2所述的环介导等温扩增引物组或权利要求3所述的检测试剂或权利要求4所述的检测试剂盒在检测布鲁氏菌中的应用。

6.一种利用环介导等温扩增检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括使用权利要求1或2所述的环介导等温扩增引物组进行扩增检测。

7.根据权利要求6所述的利用环介导等温扩增检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，扩增检测的温度为60℃-70℃。

技术总结
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种环介导等温扩增引物组及其应用，该环介导等温扩增引物组用于检测布鲁氏菌。该环介导等温扩增引物组包括如SEQIDNO.1所示的F3引物、如SEQIDNO.2所示的B3引物、如SEQIDNO.3所示的FIP引物和如SEQIDNO.4所示的BIP引物。该环介导等温扩增引物组可以对布鲁氏菌进行特异性扩增，从而快速高效检测布鲁氏菌，而且检测限在1X10<supgt;4</supgt;CFU/mL‑1X10<supgt;5</supgt;CFU/mL之间，灵敏度高。

技术研发人员：陈创夫,王震,王勇,程科健,李爽
受保护的技术使用者：石河子大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11