针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体M111及其应用

本发明属于分子生物学领域，具体涉及针对h7亚型禽流感病毒的纳米抗体m111及其应用。

背景技术：

1、禽流感病毒属于正黏病毒科，分为a、b、c、d四种不同型的流感病毒。其中a型流感病毒变异最快，根据流感病毒的表面糖蛋白血凝素和神经氨酸酶抗原不同，将a型流感病毒ha分为18种亚型(h1～h18)，na分为11种亚型(n1～n11)。而不同的ha和na理论上可形成18×11种亚型病毒。禽流感病毒可以感染野鸟和家禽，h7亚型首次在意大利传播并流行，随后在德国、巴基斯坦、美国、澳大利亚等地相继爆发h7亚型禽流感疫情，导致数百万只鸡死亡，给家禽养殖业造成了重大的经济损失。虽然目前还没有发现人传人的病例，但禽流感h7亚型已经严重威胁了人类健康与社会公共卫生安全。

2、近年来，为减少疫病的传播，抗体发挥着重要的作用。抗体的发展经历了多克隆抗体、单克隆抗体，到目前的基因工程抗体三个阶段。单克隆抗体克服了多克隆抗体特异性低，均一性差的缺点；基因工程抗体是在单克隆抗体基础上，利用基因工程手段对抗体进行改造和修饰，通过构建嵌合抗体、小分子抗体、人源化抗体、多特异性抗体等，以改善抗体效力和功能。

3、纳米抗体也称为vhh抗体，最早被hamers-casterman等人发现，是存在于骆驼科动物内的天然缺乏轻链特殊类型的抗体，后来又在羊驼、大羊驼和鲨鱼等动物也发现了纳米抗体。由于纳米抗体只有常规抗体的单个n-末端结构，因此其重链分子量低于常规分子量。纳米抗体之所以能受到广泛的关注，是由于它具有以下优点：(1)分子量小，约15ku，仅为常规igg抗体1/10；(2)稳定性强，水溶性高，不易聚集，且能在细胞内发挥作用；(3)亲和力高，纳米抗体与抗原结合的亲和力可达nm，甚至pm级；(4)能耐受极端理化环境，如在90℃高温或胃蛋白酶存在下仍具有活性；(5)可识别半抗原、隐蔽表位，甚至酶的凹槽部等常规抗体不能识别的位点；(6)易于制备，可在多种原核细胞、真核中表达，表达量高，成本低廉；(7)组织穿透性强，能穿过实体瘤和血脑屏障；(8)比常规的抗体更易于进行工程化改造。

4、在动物疫病上，可以通过噬菌体展示技术、酵母杂交和细菌展示技术筛选多种病原的纳米抗体，推动动物疫病防控技术的发展。

5、其中，酵母双杂交技术是检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的首选方法，利用该方法从cdna文库中寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白。酵母细胞中的gal4结构具有两个不同的功能域：n端的dan结合域(bd)和c端的激活域(ad)，bd和ad二者相互独立，互不干扰。若在诱饵蛋白(含有已知蛋白的基因序列)上加上bd的结构域，在猎物蛋白(含有未知蛋白的基因序列)上加上ad的结构域，诱饵蛋白和猎物蛋白相互作用时，bd和ad两个结构域在空间上相互靠近并与激活序列结合，从而使酵母特定的基因如lzcz、his3、mel1、abar等表达，使酵母能够在特定在营养缺陷培养基上进行生长并水解培养基上的无色透明的x-α-gal，从而导致菌落出现蓝斑，筛选出目的蛋白。

6、该技术是在活细胞中进行的，避免了以往的研究技术中外界因素所造成的干扰，能够检测细胞内稳定的相互作用蛋白，也能检测到微弱和短暂蛋白间的相互作用，具有较高的灵敏度。同时也具有操作方便、成本低廉、应用广泛等诸多优势。

技术实现思路

1、针对现有技术中h7亚型禽流感病毒检测过程中灵敏度低、效率低等问题，本发明利用酵母双杂交技术成功筛选出针对h7亚型禽流感病毒的纳米抗体，构建真核表达系统，并验证所筛选出的纳米抗体对h7亚型禽流感病毒的结合能力，为该病毒的中和抗体的研究及快速诊断方法的开发提供技术支持和抗体材料。

2、本发明的第一方面，是提供一种针对h7亚型禽流感病毒的纳米抗体m111，所述纳米抗体m111的氨基酸序列如seq id no：02所示。

3、本发明的第二方面，是提供一种编码上述纳米抗体m11的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no：01所示。

4、本发明的第三方面，是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码上述纳米抗体m111的基因。

5、本发明的第四方面，是提供一种转化体，所述转化体是将上述重组表达载体转化宿主细胞所得。

6、本发明的第四方面，是提供上述纳米抗体m111在制备检测h7亚型禽流感病毒药物中的应用。

7、本发明的第五方面，是提供一种检测h7亚型禽流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述纳米抗体m111。

8、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

9、(1)本发明提供一种通过真核表达系统表达的抗h7亚型禽流感病毒的纳米抗体蛋白。从而解决在原核系统中不可溶的难题，提高了准确性和重复性。

10、(2)本发明提供的抗h7禽流病毒感纳米抗体蛋白的生产方法操作简单、成本低，可实现抗h7禽流感病毒纳米抗体规模化生产。

11、(3)本发明生产的抗h7禽流感病毒纳米抗体蛋白纯度较高、检测过程中灵敏度低高，具有良好的稳定性和生物学活性，对h7禽流感的监测具有重大的意义。

技术特征：

1.一种针对h7亚型禽流感病毒的纳米抗体m111，其特征在于：所述纳米抗体m111的氨基酸序列如seq id no：02所示。

2.一种编码权利要求1所述纳米抗体m11的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no：01所示。

3.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码权利要求1所述纳米抗体m111的基因。

4.一种转化体，其特征在于：所述转化体是将权利要求3所述重组表达载体转化宿主细胞所得。

5.权利要求1所述的纳米抗体m111在制备检测h7亚型禽流感病毒药物中的应用。

6.一种检测h7亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的纳米抗体m111。

技术总结
本发明涉及针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体M111及其应用，属于分子生物学领域，本发明利用酵母双杂交技术成功筛选出针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体，构建真核表达系统，并验证所筛选出的纳米抗体对H7亚型禽流感病毒的结合能力，为该病毒的中和抗体的研究及快速诊断方法的开发提供技术支持和抗体材料。

技术研发人员：董心迎,刘珮琪,冯赛祥,曹雪薇,黄秀琴,罗开健
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12