平菇胞外多糖在制备解藻毒素毒性的药物中的应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种平菇胞外多糖在制备解藻毒素毒性的药物中的应用。

背景技术：

1、多糖(polysaccharide)是线性或分支的聚合物，由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成。食用菌多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一级结构是指其单糖残基的种类、排列顺序和连接方式等。二级结构是指多糖以氢键结合成多聚链的连接方式。三级结构是指羟基、羧基、甲基、氨基等糖残基及其他官能团通过非共价作用形成的空间构象。四级结构是指多糖多聚链间以非共价作用力结合形成的聚集体。平菇多糖是平菇子实体、菌丝体以及发酵液中提取一种高活性的功能性生理调节剂，平菇多糖具有抗肿瘤、抗病毒、降血压、降血脂、抗衰老、抗氧化、增强机体免疫力和促进消化吸收等功能。

2、微囊藻是富营养化水体中最常见的优势种，其次级代谢产物—微囊藻毒素是富营养化水体中出现频率最高、分布最广、危害最严重的环肽藻毒素。藻毒素(mcs)分子结构中氨基酸的变化能够产生近280种毒素同源物，其中，最常见、毒性最强的是微囊藻毒素-lr(microcystin-lr，mc-lr)，占淡水mcs总量的46％至99.8％。在结构上，mc-lr是一类环状七肽化合物，由5个保守氨基酸和2个可变l-氨基酸构成，2号位置和4号位置上可变性的mdha和adda存在甲基化/去甲基化差异导致mc存在多种异构体。藻毒素很容易导致水生动物肝脏脂质代谢紊乱、肝脏和肠道炎症等毒性症状。目前单位面积池塘饲料投喂量不断加大，但仅20％-25％的饲料氮被水产动物利用，75％-80％的氮存留在养殖水体及底泥中，容易导致养殖水体富营养化，而滋生大量微囊藻。

3、中国专利cn107987180a中公开了从平菇中提取多糖的方法，其具体步骤为：将平菇超微粉碎得平菇粉；向平菇粉加水，超声提取，离心，将上清液浓缩，乙醇沉淀，离心，沉淀冷冻干燥得平菇粗多糖；将平菇粗多糖溶于水中，加入酶溶液酶解，离心，再将上清液用sevage去蛋白得脱蛋白多糖液；采用阴离子交换层析柱分级纯化，透析，浓缩即得不同级分的平菇多糖，乙醇沉淀，冷冻干燥得平菇多糖；用sephadexg-100凝胶层析纯化，冷冻干燥，即得平菇多糖纯品。该发明提取方法简单可行，平菇多糖的提取率高、纯度高，具有良好的应用价值和市场潜力，能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，保持多糖的活性不被破坏。

4、但尚未见有高效制备平菇胞外多糖的方法及其在调节藻毒素诱导蛙蝌蚪肝脏和肠道等适应症和提升机体外排藻毒素能力中的应用。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种平菇胞外多糖在制备解蛙类藻毒素毒性药物中的应用。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了一种平菇胞外多糖的提取方法，包括以下步骤：

4、s1：使用上述的培养基接种菌种，发酵，得发酵产物；

5、s2：发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液；

6、s3：将发酵液过滤，减压蒸馏，加入乙醇，离心，干燥，得平菇胞外多糖干粉。

7、优选地，所述s1中培养基包括：玉米浆和豆渣，所述培养基中玉米浆的浓度为5-12g/l；所述培养基中豆渣的浓度为20-30g/l。

8、进一步优选地，所述培养基中玉米浆的浓度为8g/l。

9、进一步优选地，所述培养基中豆渣的浓度为25g/l。

10、优选地，所述培养基还包括糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸铵。

11、优选地，所述糖选自单糖、二糖中的至少一种。

12、进一步优选地，所述单糖选自果糖、葡萄糖、半乳糖中的至少一种。

13、进一步优选地，所述二糖选自蔗糖、麦芽糖、纤维二糖中的至少一种。

14、最优选地，所述糖为蔗糖。

15、优选地，所述培养基中糖的浓度为10-20g/l；

16、进一步优选地，所述培养基中糖的浓度为15g/l。

17、优选地，所述培养基中磷酸二氢钾的浓度为0.05-2g/l；

18、进一步优选地，所述培养基中磷酸二氢钾的浓度为1g/l。

19、优选地，所述培养基中硫酸镁的浓度为0.01-1g/l；

20、进一步优选地，所述培养基中硫酸镁的浓度为0.05g/l。

21、优选地，所述培养基中硫酸铵的浓度为1-5g/l；

22、进一步优选地，所述培养基中硫酸铵的浓度为3g/l。

23、优选地，所述s1中菌种为苏引六号平菇菌种。

24、优选地，所述菌种的浓度为8-12％(v/v)；

25、进一步优选地，所述菌种的浓度为10％(v/v)。

26、优选地，所述s1还包括前处理步骤，具体为将培养基灭菌；

27、进一步优选地，所述灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为20min。

28、优选地，所述灭菌机的旋转转数为130-160r/min；

29、进一步优选地，所述灭菌机的旋转转数为150r/min。

30、优选地，所述s1中发酵时的通气量为10-30nl/min；

31、进一步优选地，所述s1中发酵时的通气量为20nl/min。

32、优选地，所述s1接种后还包括培养步骤，所述培养的温度为25-30℃，培养的时间为3-5d；进一步优选地，所述培养的温度为28℃，培养的时间为4d。

33、优选地，所述s3中发酵液过滤采用4-6层纱布过滤；

34、进一步优选地，所述s3中发酵液过滤采用4层纱布过滤。

35、优选地，所述s3中减压蒸馏至原体积5-15％；进一步优选地，所述减压蒸馏至原体积的10％。

36、优选地，所述s3中乙醇的体积浓度为85-95％；进一步优选地，所述乙醇的体积浓度为95％。

37、优选地，所述s3中乙醇的加入量为发酵液体积的3-6倍；进一步优选地，所述乙醇的加入量为发酵液体积的4倍。

38、优选地，所述s3中加入乙醇后还包括沉淀步骤，所述沉淀的温度为2-6℃，沉淀的时间为20-30h；

39、进一步优选地，所述沉淀的温度为4℃，沉淀的时间为24h。

40、优选地，所述s3中干燥的方式选自冷冻干燥、超临界干燥、常压干燥中的一种或多种。

41、进一步优选地，所述s3中干燥的方式为冷冻干燥。

42、再进一步优选地，所述冷冻干燥的温度为-40℃至-50℃，冷冻干燥的时间为30-40h；

43、最优选地，所述冷冻干燥的温度为-45℃，冷冻干燥的时间为36h。

44、又一方面，本发明提供了上述的提取方法提取的平菇胞外多糖在制备解蛙类藻毒素毒性的药物中的应用。

45、优选地，所述药物中按照重量份数计包括平菇胞外多糖0.1-2份；

46、进一步优选地，所述药物中按照重量份数计包括平菇胞外多糖0.5-1份；

47、最优选地，所述药物中按照重量份数计包括平菇胞外多糖0.5份。

48、优选地，所述平菇胞外多糖可以与其他解藻毒素毒性的活性成分联用。

49、优选地，所述藻毒素毒性包括导致肝脏脂质过度积累、肝脏和肠道的炎症发生、肠道内lps含量升高、肠道的溶菌酶含量降低、肝脏的gsh水平下降和肝脏的gst活力下降。

50、优选地，所述平菇胞外多糖的数均分子量为3.83×102-1.54×104da；

51、优选地，所述平菇胞外多糖的重均分子量为3.93×102-1.83×104da；

52、优选地，所述平菇胞外多糖的粘均分子量3.92×102-1.78×104da；

53、优选地，所述平菇胞外多糖的分布宽度为1.03-1.21。

54、具体的，所述数均分子量是所有分子的分子量和其所占数量分数的乘积之和，数均分子量的物理意义是不同分子量分子的分数及其对应的分子量产物的总和。

55、具体的，所述重均分子量是将所有分子的分子量和其所占重量分数的乘积之和。

56、具体的，所述粘均分子量是用稀溶液粘度法测得的聚合物的分子量。

57、具体的，所述da为道尔顿，是将分子中所有原子按个数求原子量的代数和。

58、优选地，所述平菇胞外多糖的单糖包括：乳糖(gal)、阿拉伯糖(ara)、葡萄糖(glu)、鼠李糖(rha)、甘露糖(man)、木糖(xyl)和核糖(rib)。

59、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

60、(1)本发明对平菇胞外多糖的制备工艺进行改进，提供了一种新的平菇胞外多糖的提取方法，使用该方法制得的平菇胞外多糖能够降低由藻毒素-lr诱导的甘油三脂(tg)、胆汁酸(tba)和胆固醇(tcho)等血脂指标、谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)肝功能指标和脂多糖内毒素含量。

61、(2)本发明提取的平菇胞外多糖降低了由mc-lr诱导的肝脏组织损伤水平、肝脂代谢指标(tg、tba和tcho)、肝脏组织中嗜酸性粒细胞数量、炎症因子白介素-1β(il-1β)、活性氧(ros)和肝体指数(hsi)。

62、(3)本发明提取的平菇胞外多糖增加了肝脏mc-lr外排水平，mc-lr外排过程关键性指标谷胱甘肽-s-转移酶活力(gst)和谷胱甘肽(gsh)含量，肝脏、脑、肠道、性肾复合体、鳃、皮肤、肌肉等组织中mc-lr积累量减少。

63、(4)本发明提取的平菇胞外多糖降低了由mc-lr诱导的肠道组织损伤水平、lps含量、炎症因子il-1β和ros，此外，增加了肠道非特异免疫物质溶菌酶(lzm)含量。