过表达MtWUSCHEL基因在提高豆科牧草叶面积和延迟开花中的应用

过表达mtwuschel基因在提高豆科牧草叶面积和延迟开花中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种茎尖干细胞决定相关的转录因子wuschel(wus)基因的应用，尤其涉及一种过表达蒺藜苜蓿mtwuschel(简称mtwus)基因在增加豆科牧草(如紫花苜蓿)叶片面积和延迟开花中的应用。属于生物基因工程技术领域。


背景技术：

2.紫花苜蓿素有“牧草之王”的美称，是世界上利用最早、栽培最广的一种优良的豆科牧草，是畜牧业生产中重要的蛋白饲料来源之一，因兼具抗逆性强、产量高、适口性佳等优点，具有极大的生产利用潜力和研究价值。但我国的紫花苜蓿存在产量较低、品质较差等问题，远远不能满足畜牧业和草业发展的多方面的需求，因此迫切需要提高苜蓿的产量和质量水平，以满足市场的需要。
3.苜蓿的蛋白质主要存在于叶片中，而且叶片最多可贡献产草量的60％，因此叶片不仅是苜蓿生长发育、产量构成和品种特性的重要指标，更是反映苜蓿牧草营养价值的重要指标之一。一般而言，叶片面积越大，蛋白质含量越丰富，苜蓿的营养价值就越高，利用价值也就相对越高。因而叶量丰富、蛋白含量高、品质优质的苜蓿新品种的选育一直是苜蓿育种工作者追求的目标。
4.开花是苜蓿从营养生长到生殖生长转变的关键，在花期时牧草质量下降是牧草作物普遍存在的问题，这对苜蓿牧草产量的影响很大。设法延迟苜蓿开花，有望在以下几个方面得到改善：一是其营养生长阶段被延长，生物量的积累增加，且更长时间地保持牧草的高品质；二是通过延迟开花，还可以保护植株免受冬末和早春霜冻的影响；三是可以通过延长苜蓿的收获时间来方便田间管理。然而目前苜蓿开花时间和生物量调控的遗传和基因组基础仍不清楚，这主要是由于该物种的同源多倍体特性和缺乏足够的基因组资源。
5.wus是wox(wuschel-related homeobox)基因家族的成员，在植物发育的关键时期起到重要的调控作用，包括干细胞生态位的维持和茎顶端分生组织(sam)的发育等(clark,2001；fletcher,2002；kieffer et al.,2006；laux et al.,1996)。水稻中oswus的功能缺失，导致分蘖数降低(xia et al.,plant journal,2020,104,1635-1647)。在玉米中，zmwus1和zmwus2在腋生分生组织(am)中高表达，参与了分枝调控等(nardmann and werr,2006)。在蒺藜苜蓿中，有报道wus的同源基因hdl(headless)作为一个转录抑制因子发挥功能。hdl的功能缺失突变体表现为腋生分生组织发育受阻并丧失顶端优势、叶片呈心形等(ikeda et al.,2009；meng et al.,2019)。但关于过表达蒺藜苜蓿mtwuschel基因在增加豆科牧草(如紫花苜蓿)叶片面积和延迟开花中的应用还未见报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种过表达蒺藜苜蓿mtwuschel(mtwus)基因在增加豆科牧草叶片面积和延迟开花中的应用。
7.本发明所述过表达蒺藜苜蓿mtwuschel(mtwus)基因在增加豆科牧草叶片面积和延迟开花中的应用；其中所述蒺藜苜蓿mtwuschel基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，该基因编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述应用是通过rt-pcr技术从蒺藜苜蓿中克隆mtwuschel基因编码序列，构建植物过表达载体，进行植物转基因操作导入豆科牧草植物细胞，获得过表达mtwuschel基因的豆科牧草转基因株系实现。
8.上述的应用中：所述豆科牧草优选是紫花苜蓿或蒺藜苜蓿。
9.上述的应用中：所述植物过表达载体优选是pearleygate103-mtwus。
10.本发明所述过表达蒺藜苜蓿mtwuschel基因在提高紫花苜蓿的牧草品质中的应用；其中所述蒺藜苜蓿mtwuschel基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.申请人利用引物mtwus-f(caccatggaacagcctcaacaacaacaac)和mtwus-r(ttaattagcataatctggtgacctacagc)，通过rt-pcr技术从蒺藜苜蓿中克隆mtwus基因编码序列，构建植物过表达载体pearleygate103-mtwus，进行植物转基因操作导入紫花苜蓿植物细胞，获得过表达mtwus基因的紫花苜蓿转基因株系。检测表明，过表达mtwus植株的叶片面积增大，牧草品质显著提高，同时开花时间显著延迟(约20天)，这一数据远高于目前现有的苜蓿品种。
12.本发明的有益效果是：首次应用所述蒺藜苜蓿mtwuschel基因在复叶物种苜蓿中过表达显著提高了转基因植株的叶片面积并延迟了开花时间(见图1和图2)，结果显示可以使紫花苜蓿的开花时间延迟高达20天，并且可以使叶片面积提高约11％。预示本发明所述应用有望在培育新型豆科牧草植物品种中发挥重要的作用，此也为作物改良性提供了新的理论依据和实践基础，对促进我国草业经济作物的生产具有重大意义。
附图说明
13.图1.过表达mtwus基因的转基因紫花苜蓿株系的开花时间分析。
14.其中，a是wt和mtwus过表达植株整株表型，b是wt植株顶端开花表型，c-e是mtwus过表达植株不同株系顶端未开花表型，f是wt和mtwus过表达植株第一朵花出现的节间位置数统计，g是wt和mtwus过表达植株第一朵花出现的天数统计；wt为野生型，oe-1、oe-3和oe-5为mtwus过表达植株不同株系。
15.结果显示紫花苜蓿的野生型植株在40天左右开花，过表达mtwus基因的转基因紫花苜蓿植株在60天左右开花，这说明mtwus基因过表达之后明显延迟了紫花苜蓿的开花时间。
16.图2.过表达mtwus基因的转基因紫花苜蓿株系的叶片表型及相关指标分析。
17.其中，a是wt和mtwus过表达植株叶片表型，b是wt和mtwus过表达植株叶面积统计，c是wt和mtwus过表达植株叶片长宽比统计，d是wt和mtwus过表达植株叶片粗蛋白含量测定，e是wt和mtwus过表达植株鲜重统计，f是wt和mtwus过表达植株叶片总叶绿素、叶绿素a及叶绿素b含量统计；wt为野生型，oe-1、oe-3和oe-5为mtwus过表达植株不同株系。
18.结果显示：与野生型相比，过表达mtwus基因的转基因紫花苜蓿植株的叶片变大并且叶片颜色更加绿。为此选取生长状态一致的野生型和mtwus过表达植株，分别统计叶片面积、叶片宽长比、叶片粗蛋白含量、鲜重和叶绿素含量。测定结果发现mtwus过表达植株的叶片面积、叶片宽长比、叶片粗蛋白含量、鲜重和叶绿素含量明显高于野生型，表明了mtwus基
因在改良豆科牧草中有显著作用。
具体实施方式
19.下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
20.下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(sambrook和russell,2001)。
21.下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、载体等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
22.本实施例中所述的pearleygate103过表达载体构建见“keith w earley,jeremy r haag,olga pontes,kristen opper,tom juehne,keming song,craig s pikaard.2006.gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.plant j.”一文。
23.10
×
n6大量盐母液(1l)：mgso4·
7h2o 1.85g，kno
3 28.3g，(nh4)2so
4 4.63g，cacl2·
2h2o 1.66g，kh2po
4 4g。
24.1000
×
sh微量盐母液(100ml)：mnso4·
h2o 1g，h3bo
3 500mg，znso4·
7h2o 100mg，ki 100mg，na2moo4·
2h2o 10mg，cuso4·
5h2o 20mg，cocl2·
6h2o 10mg。
25.1000
×
sh有机母液(100ml)：烟酸500mg，盐酸吡哆醇500mg，盐酸硫胺素500mg。
26.50
×
edfs铁盐母液(500ml)：nafe
·
edta 3.487g。
27.sh9培养基(1l)的配方为：10
×
n6大量盐母液100ml，1000
×
sh微量盐母液1ml，1000
×
sh有机母液1ml，50
×
edfs铁盐母液20ml，肌醇100mg，蔗糖20g，ph调整至5.8。固体培养基中加入7g琼脂。
28.sm4培养基(1l)的配方为：murashige&skoog(ms)basal medium(m519)(phyto technology laboratoriestm)4.43g，2,4-d储存液(10mg/ml)0.4ml，6-bap储存液(1mg/ml)0.2ml，蔗糖30g，ph调整至5.8。固体培养基中加入3g植物凝胶。
29.msbk培养基(1l)的配方为：murashige&skoog(ms)basal medium(m519)(phyto technology laboratoriestm)4.43g，激动素(1mg/ml)1ml，6-bap储存液(1mg/ml)0.5ml，蔗糖30g，ph调整至5.8。固体培养基中加入3g植物凝胶。
30.1/2ms培养基(1l)的配方为：murashige&skoog(ms)basal medium(m519)(phyto technology laboratoriestm)2.215g，蔗糖12g，ph调整至5.8。固体培养基中加入7g琼脂。
31.实施例1过表达蒺藜苜蓿mtwus基因转紫花苜蓿植株的获得
32.1.过表达mtwus载体的构建
33.1.1通过生物信息学网站ncbi获得如seq id no.1所示的mtwus基因的编码序列。根据该编码序列设计引物mtwus-f(caccatggaacagcctcaacaacaacaac)和mtwus-r(ttaattagcataatctggtgacctacagc)。利用trizol试剂盒提取蒺藜苜蓿总rna，反转录为cdna。以cdna为模板，利用rt-pcr方法扩增mtwus基因的全长cds序列。利用gateway技术将mtwus基因序列连入pearleygate103载体，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆，测序。将获得的过
表达载体pearleygate103-mtwus，转化农杆菌eha105，鉴定阳性克隆，-80℃保存备用。
34.1.2农杆菌介导的紫花苜蓿叶盘遗传转化
35.将步骤1.1中获得的-80℃保存的农杆菌划线接种于yep固体培养基(含100mg/l利福平和50mg/l卡那霉素)，28℃倒置培养2天，挑单克隆进行菌落pcr鉴定。挑阳性单菌落接种于添加利福平和卡那霉素的yep液体培养基过夜培养，至od
600
为0.8，28℃4000rpm离心15min，弃上清，用转化液将菌稀释至od
600
为0.2，备用。
36.1.3外植体的准备
37.取紫花苜蓿从顶芽往下数第3-5片完全展开的复叶作为外植体，采集后在超净工作台中用含有0.1％tritonx 100和30％次氯酸钠的漂白水(有效成分为0.5％次氯酸钠)消毒15min，再用无菌水清洗3遍后备用。
38.1.4农杆菌的侵染和共培养
39.将步骤1.3中获得的外植体放入盛有步骤1.2制备的侵染菌液中，抽真空至-0.09mpa维持10min，然后缓慢放气，于脱色摇床上轻摇10min。将外植体放置在无菌滤纸上，吸净侵染液后，摆放在共培养培养基上，22℃黑暗培养3天。
40.1.5愈伤组织诱导和分化
41.将外植体转移至含有抗生素ppt(3mg/l)和头孢霉素500mg/l的sm4固体培养基上诱导抗性愈伤，22℃，16h光照/8h黑暗培养，每2周继代一次，共3次；随后将愈伤转移至含有筛选抗生素ppt(3mg/l)和头孢霉素500mg/l的msbk固体培养基上诱导芽分化，22℃，16h光照/8h黑暗培养，持续3周；将胚性愈伤转移至含有筛选抗生素抗生素ppt(3mg/l)和头孢霉素200mg/l的sh9固体培养基上继续诱导芽分化，22℃，16h光照/8h黑暗培养，每3周继代一次，直至产生再生苗；将再生苗转移至1/2ms固体培养基上生根，每3-4周继代一次，22℃，16h光照/8h黑暗培养，生根后移栽至土中。
42.1.5紫花苜蓿再生苗的鉴定
43.取再生苗的一个小叶片提取基因组dna，然后进行pcr检测。以质粒pearleygate103-mtwus载体为阳性对照，引物为35s-f(gcacaatcccactatccttc)和mtwus-r(ttaattagcataatctggtgacctacagc)进行pcr扩增。确定获得过表达蒺藜苜蓿mtwus基因的转基因植株。
44.pcr所用的酶为北京全式金生物的dna polymerase(目录号：ap111-01)，具体使用方法见说明书。
45.实施例2过表达蒺藜苜蓿mtwus基因转紫花苜蓿植株的开花时间统计分析
46.通过从蒺藜苜蓿中克隆mtwus基因，利用农杆菌eha105转化紫花苜蓿，最后筛选获得在紫花苜蓿背景下的过表达蒺藜苜蓿mtwus基因的转基因紫花苜蓿株系。对转基因植株的表型进行分析，结果见图1。
47.结果显示过表达植株可以显著延迟开花时间。野生型的开花时间在40天左右，而过表达植株的开花时间在60天左右，延迟了近20天(图1g)。此外与野生型相比，过表达植株开花时的节间数也显著增加(图1f)。
48.实施例3过表达蒺藜苜蓿mtwus基因转紫花苜蓿植株的株型分析
49.通过从蒺藜苜蓿中克隆mtwus基因，利用农杆菌eha105转化紫花苜蓿，最后筛选获得在紫花苜蓿背景下的过表达蒺藜苜蓿mtwus基因的转基因紫花苜蓿株系。对过表达蒺藜
苜蓿mtwus基因转基因植株的表型进行分析，结果见图2。
50.结果显示：与野生型相比，过表达mtwus基因的转基因紫花苜蓿植株的叶片变大并且叶片颜色更加绿，即过表达植株的叶片面积与野生型相比显著增加，可以使叶片面积提高约11％(图2a-b)。为此选取生长状态一致的野生型和mtwus过表达植株，分别统计叶片面积、叶片宽长比、叶片粗蛋白含量、鲜重和叶绿素含量。测定结果显示mtwus过表达植株的叶片面积、叶片宽长比、叶片粗蛋白含量、鲜重和叶绿素含量均明显高于野生型(图2c-f)，表明了mtwus基因在改良豆科牧草中有显著作用。
51.实施例4过表达蒺藜苜蓿mtwus基因转紫花苜蓿植株的牧草品质分析
52.通过从蒺藜苜蓿中克隆mtwus基因，利用农杆菌eha105转化紫花苜蓿，最后筛选获得在紫花苜蓿背景下的过表达蒺藜苜蓿mtwus基因的转基因紫花苜蓿株系。对过表达蒺藜苜蓿mtwus基因转基因植株的牧草品质进行分析，结果见表1。
53.选取生长状态一致的野生型和过表达植株，通过近红外质谱分析，分别测定野生型和过表达植株中的各项品质相关指标。
54.表1：品质相关指标检测结果
[0055][0056]
结果表明，过表达植株粗蛋白、粗脂肪、水溶性糖的含量相比野生型都明显升高，另外氮、钾和植物碳的含量相比野生型也明显提高。这表明过表达mtwus基因明显提高了紫花苜蓿的牧草品质。