短小芽孢杆菌lymc-3和其发酵液的新应用及其发酵液的制备方法
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及短小芽孢杆菌lymc-3和其发酵液的新应用及其发酵液的制备方法。
背景技术：
2.菊花灰霉病在菊花生长期容易发生，严重时可引起大量落叶，影响植株开花，降低观赏价值；主要为害菊花叶、茎和花等部位。叶受害时在叶片边缘出现褐色病斑，表面略呈轮纹状波皱，叶柄和花柄先软化后外皮腐烂，花受害时影响种子成熟；高温多雨、氮肥施用过多、栽植过密、土壤质地黏重等都有利于病害发生；病菌侵染花器，产生水渍状褐色病斑，湿度大时，病部生浅灰黑色霉状物，即病菌分生孢子梗和分生孢子。
3.近年来，在菊花灰霉病的防治上，由于人们大量使用化学农药，虽然能够减轻一些菊花病害的发生，但给自身及生态环境带来了许多负面影响，如环境污染加剧，土壤及作物农药残留严重，病菌抗药性的产生加快，严重威胁着人们的生命财产安全。
4.短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)是常见的生防微生物，具有生物防治，生物降解以及促进植物生长等多种功能。短小芽孢杆菌可以防治多种植物病害，如对稻瘟病、鹰嘴豆根腐病、黄瓜枯萎病及棉花黄萎病等都具有显著的防治效果。因此在农业生产中，利用生物菌芽孢杆菌的生物菌剂代替化学农药和杀菌剂的作用有非常广阔的前景，既能对植物病虫害的发生起抑制作用，很大程度上又维持了生态系统的稳定，还对人类健康和环境副作用小。
5.然而，菊花灰霉病是菊花生长上常见的病害，危害非常严重，迫切需要新型生物防治药剂进行防治。
技术实现要素：
6.针对现有技术存在的不足，本发明提出一种短小芽孢杆菌lymc-3和其发酵液的新应用及其发酵液的制备方法，以提供一种短小芽孢杆菌lymc-3及其发酵液的新应用，满足在防治菊花灰霉病中的使用，解决使用化学农药防治花灰霉病，导致环境受到污染的问题。
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种短小芽孢杆菌lymc-3，所述短小芽孢杆菌lymc-3的应用于菊花灰霉病的防治。
8.本发明还提供一种根据以上短小芽孢杆菌lymc-3的发酵液，所述发酵液为无菌发酵液，所述无菌发酵液应用于菊花灰霉病的防治。
9.本发明还提供一种根据以上短小芽孢杆菌lymc-3的发酵液的制备方法，包括以下步骤：
10.将保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上的短小芽孢杆菌lymc-3接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50ml的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；将摇培2天后的发酵液，经4℃、10000r/m冷冻离心20min，得到发酵上清液，用0.22μm的细菌过滤器过滤，
即得无菌发酵液。
11.与现有技术相比，本方案产生的有益效果是：
12.本发明的短小芽孢杆菌lymc-3及其发酵液，通过室内活性测定试验和田间防效试验均表明，短小芽孢杆菌lymc-3菌株和发酵液对菊花灰霉病均有很好的防治效果，从而能够实现减少化学农药的使用，实现对环境更好地保护。
具体实施方式
13.下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
14.本技术所采用的短小芽孢杆菌lymc-3，为本技术人前期研究成果的中国专利申请cn106754586b公开的短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)lymc-3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2016775。
15.本发明提供的短小芽孢杆菌lymc-3在防治菊花灰霉病中的应用。
16.本发明提供的短小芽孢杆菌lymc-3的发酵液在防治菊花灰霉病中的应用。
17.本发明提供的短小芽孢杆菌lymc-3的发酵液的制备方法：
18.将保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上的短小芽孢杆菌lymc-3接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50ml的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；将摇培2d，取得发酵液后，经4℃、10000r/m冷冻离心20min，得到发酵上清液，用0.22μm的细菌过滤器过滤即得无菌滤液。
19.其中，本技术所用菌株是从洛阳马尾松茎部分离筛选出的具有杀线活性的高效拮抗细菌——lymc-3菌株，并对该菌株的形态进行了观察，同时研究其一系列生理生化指标，利用biolog技术和16s rdna序列技术分析，最终确定菌株lymc-3为短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)。短小芽孢杆菌lymc-3具有内生性，能在马尾松体内良好地定殖和传导，其无菌发酵滤液具有很强的杀线作用。
20.试验数据
21.试验例一、短小芽孢杆菌lymc-3菌株对菊花灰霉病室内活性测定
22.1、短小芽孢杆菌lymc-3的活化和悬浮液制备
23.配制na培养基，121℃高温高压灭菌20分钟，在无菌操作台中，将灭菌的培养基倒入无菌培养皿中，待培养基凝固且培养皿中无水蒸汽时，采用平板划线法将短小芽孢杆菌lymc-3菌种在培养基上划线分离，多次活化，直至获取单菌落，于28℃恒温培养箱中培养。
24.试验前，用无菌水清洗培养皿表面菌落，制成l0*12cfu/ml菌悬浮液。
25.2、短小芽孢杆菌lymc-3菌悬浮液浓度测定
26.采用吸光度(abs值)测定法。
27.取菌液，按不同的设定稀释倍数(5、10、20、40倍)，依次进行稀释，在660nm 标准波长下，测得一组不同菌液浓度的吸光度。在无菌室内火焰旁进行操作。分别依次测定四个不同稀释倍数的菌落数。每个稀释倍数依次制定几个浓度梯度，用灭菌吸管各吸取1ml注入平皿。注入约15ml，45～50℃的营养琼脂培养基，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待培养基凝固后，置28℃
±
1℃培养箱内培养24h后，进行菌落计数。用肉眼观察，点出菌落数，记下各平皿的菌落数后,求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。以吸光度abs值
为横坐标，稳定期的菌液浓度为纵坐标绘制标准曲线，并计算菌悬浮液浓度。
28.3、lymc-3菌悬浮液对菊花灰霉病室内活性测定
29.采用盆栽苗喷雾法。选择1张真叶期长势一致的盆栽菊花苗，喷雾处理后自然晾干。处理后24h后进行接种，取新鲜菊花灰霉病病叶，用蒸馏水洗下病叶背面孢子，制备成孢子悬浮液(3
×
105个/ml)。用微型喷雾器在菊花苗上均匀喷雾接种孢子悬浮液。处理后保持相对湿度90～100％，温度20℃，6d后视空白对照发病情况进行分级调查，按病指计算防效。
30.请一并参阅表1，结果表明，在0.5、0.8、1.0
×
l0
*12
cfu/ml剂量下，病原菌抑制率可达75-95％，显示出优异的活性，表明短小芽孢杆菌lymc-3菌株可有效防治菊花灰霉病的危害。。
31.药剂剂量(l0
*12
cfu/ml)病原菌抑制率％菌悬浮液0.575菌悬浮液0.887菌悬浮液1.095
32.表1
33.试验例二、短小芽孢杆菌lymc-3菌株的发酵液对菊花灰霉病室内活性测定
34.1.短小芽孢杆菌lymc-3菌株发酵液制备
35.取100ml容量瓶若干，每瓶装液50ml，灭菌后挑取纯化的lymc-3菌株单菌落进入摇瓶中，在28℃、200r/min的条件下摇培2d，取得发酵液后，经4℃、10000r/m冷冻离心20min，得到发酵上清液，用0.22μm的细菌过滤器过滤即得无菌滤液。
36.2.对菊花灰霉病病原菌抑制率测定
37.采用盆栽苗喷雾法。选择1张真叶期长势一致的盆栽菊花苗，喷雾处理后自然晾干。处理后24h后进行接种，取新鲜菊花灰霉病病叶，用蒸馏水洗下病叶背面孢子囊，制备成孢子悬浮液(3
×
105个/ml)。用微型喷雾器在菊花苗上均匀喷雾接种孢子悬浮液。处理后保持相对湿度90-100％，温度20℃，6d后视空白对照发病情况进行分级调查，按病指计算防效。
38.请一并参阅表2，结果表明，在稀释10、5、1倍剂量下，病原菌抑制率可达70～95％，显示出优异的活性，表明短小芽孢杆菌lymc-3菌株的发酵液可有效防治菊花灰霉病的危害。
39.药剂剂量(稀释倍数)病原菌抑制率％菌株发酵液1070菌株发酵液590菌株发酵液195
40.表2
41.试验例三、短小芽孢杆菌lymc-3菌株的田间防效试验
42.菌悬浮液按1千克/亩于菊花灰霉病发生初期兑水进行植株叶面均匀喷雾。试验作物为菊花，栽培品种为金丝皇菊。采用扦插繁殖苗移栽。试验时，作物处于营养生长及花蕾前期。调查时每小区随机取5点，每点10株苗，每株调查全部展开叶片，调查病级，计算病情指数和防效。结果表明，在1
×
l0
*12
cfu/ml 浓度下，药后3天、7天防效分别为81.5％、83.1％，表明短小芽孢杆菌lymc
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3菌株可有效防治菊花灰霉病的危害。
43.试验例四、lymc-3菌株的发酵液对菊花灰霉病田间防效试验
44.菌发酵液按1千克/亩于菊花灰霉病发生初期兑水进行植株叶面均匀喷雾。试验作物为菊花，栽培品种为金丝皇菊。采用扦插繁殖苗移栽。试验时，作物处于营养生长及花蕾前期。调查时每小区随机取5点，每点10株苗，每株调查全部展开叶片，调查病级，计算病情指数和防效。结果表明，在菌株发酵液1倍剂量下，药后3天、7天防效分别为86.7％、88.1％。表明lymc-3菌株的发酵液可有效防治菊花灰霉病的危害。
45.通过以上试验例一至试验例四中室内活性测定试验和田间防效试验，均表明，短小芽孢杆菌lymc-3菌株和发酵液对菊花灰霉病均有很好的防治效果，从而能够实现减少化学农药的使用，实现对环境更好地保护。
46.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。